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编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 除甾醇和硫代葡萄糖苷生物合成途径外，甲羟戊酸（MVA）途径与其他代谢途径之间的关系尚不清楚。在MVA途径中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶（HMGS）催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合形成HMG-CoA。我们以前的研究表明，虽然重组芥菜型油菜HMGS1（BjHMGS1）突变体S359A的酶活性比野生型（wt）BjHMGS1高10倍，但转基因烟草过度表达S359A（OE-S359A）比OE-wtBjHMGS1表现出更高的甾醇含量、生长速率和种子产量。在本篇文章中，非靶向蛋白质组学和靶向代谢组学被用来研究烟草中HMGS过度表达的表型效应，检测哪些其他代谢途径受到影响。对OE-wtBjHMGS1和OE-S359A的SWATH-MS定量蛋白质组学分析表明，OE-S359A在初级代谢和细胞壁修饰中存在蛋白质的失调，而一些与光合作用和三羧酸循环相关的蛋白质在OE-S359A中表达上调。代谢组学分析表明，HMGS-OEs中碳水化合物、氨基酸和脂肪酸的含量发生了相应的变化，HMGS特异性抑制剂F-244在烟草上的应用证实了这一点。最后，乙酰辅酶a配体S359A的晶体结构表明，S359A活性的提高可能是由于Ser359和酰基辅酶a之间的氢键丢失所致，这在wtBjHMGS1中很明显。本研究表明，HMGS对植物生长的调控可以影响中枢代谢途径；此外，本研究还表明，在烟草中应用HMGS特异性抑制剂（F-244）是研究HMGS/MVA途径的有效途径。 论文ID 实验设计 1. 采用SWATH-MS分析HMGS OEs中蛋白质的差异表达； 2. 利用HMGS特异性抑制剂(F-244)研究烟草中HMGS/MVA通路的功能； 实验结果 1. SWATH-MS分析显示HMGS OEs中蛋白质的差异表达 烟草HMGS OEs中差异表达蛋白（DEPs）的SWATH-MS定量蛋白质组学分析，其中HMGS显著上调，我们共鉴定出2080个蛋白质、12225个肽和105个，与WT相比，OE-wtBjHMGS1中599个频谱计数的全局错误发现率（FDR）小于1%。在这些蛋白质中，有1033个蛋白质显示出变化；在OE-wtBjHMGS1中，119个蛋白表达显著上调（P<0.05），91个蛋白表达下调。我们将OE-S359A与WT进行比较，共获得2163个蛋白质、13312个肽和112139个光谱计数，总FDR小于1%。在这些蛋白质中，有1432种蛋白质显示出变化；89种蛋白表达显著增加（P<0.05），83种蛋白表达显著降低。当OE-S359A与OE-wtBjHMGS1比较时，我们共观察到2162个蛋白质、12836个肽和111759个谱计数，总FDR小于1%。在这些蛋白质中，有1436个蛋白质发生了明显的变化，其中116个蛋白表达显著增强（P<0.05），128个蛋白表达下降。当烟草HMGS OEs中的dep被分为不同的功能类别时，“蛋白质”和“光合作用”似乎是每对比较中最丰富的类别：OE-wtBjHMGS1/WT（补充图S1A）、OE-S359A/WT（补充图S1B）或OE-S359A/OE-wtBjHMGS1（补充图S1C）。与WT相比，OE-wtBjHMGS1中46个与蛋白质代谢相关的DEP中有28个增加，而27个与光合作用相关的DEP中有22个减少（补充图S1A；补充表S3）。而与野生型相比，OE-S359A诱导了38个蛋白质合成和代谢DEPs中的22个和13个光合作用DEPs中的9个（补充图S1B；补充表S4）。当OE-S359A与OEwtBjHMGS1进行比较时，26个DEPs中的23个在光合作用中升高，而OE-S359A中47个与蛋白质合成和代谢相关的DEPs中的32个下降（补充图S1C；补充表S5）。这些结果表明HMGS的过度表达可以影响蛋白质的合成和代谢以及光合作用，OE-S359A在上调光合作用相关蛋白方面比OE-wtBjHMGS1更为活跃，但在蛋白质合成和代谢方面则不活跃（补充图S1C）。此外，OE-wtBjHMGS1中包括“RNA”、“细胞组织、细胞分裂和囊泡运输”、“杂项（MISC）”、“细胞壁”、“发育”、“应激”、“DNA”和“次级代谢”在内的大多数DEP在WT中增强（图1A；补充图S1A、S2A；补充表S1）；与WT相比，OE-S359A中“蛋白质”、“光合作用”、“脂质代谢”、“细胞壁”和“发育”中的大多数DEPs增加（图1B；补充图S1B、S2B；补充表S2）。此外，OE-S359A中“氧化还原”、“MISC”、“信号”和“传输”簇中的DEP高于OE-wtBjHMGS1（图1C；补充图S1C、S2C；补充表S6）。 图1 蛋白质组学分析发现，与野生型相比，20日龄烟草HMGS-OE幼苗的差异表达蛋白（DEPs）与光反应和碳水化合物代谢有关。上调的DEPs（P<0.05）用红色表示，下调的DEPs（P<0.05）用蓝色表示。A、OE-wtBjHMGS1与WT（绿色）；B、OE-S359A与WT（紫色）；C、OE-S359A与OE-wtBjHMGS1（粉色）。 2. 利用HMGS特异性抑制剂(F-244)研究烟草中HMGS/MVA通路的功能 在14日龄烟草幼苗中，wt和突变体BjHMGS1（S359A）的过表达导致甾醇的积累，根长和干重增加。先前的一项研究报道，HMGS的一种特异性抑制剂F-244在温室烟草的喷雾中没有表现出有效性。我们先前的研究表明，F-244对His6-BjHMGS1非常有效，并且F-244在HMGS反应中心不可逆地结合到Cys117并停止缩合。鉴于Cys117在烟草HMGS亚型中是保守的（补充图S3），我们预计F-244在烟草中也会表现出类似的效果。为了查明HMGS的这些表型变化，并为研究HMGS在烟草中的作用建立另一种独立的方法，我们将F-244应用于WT烟草幼苗。结果表明，使用10 μm F-244可有效地延缓初生根和根毛的生长，且这种作用呈剂量依赖性（图2）。经过10 μM和20 μM F-244处理后，野生烟草幼苗的鲜重分别降低了31%和52%（图2A，B）；10 μM和20 μM F-244处理后，初生根长度分别减少43%和54%，20 μM F-244处理的幼苗比10 μM F-244处理的幼苗短18%（图2A，B）。此外，与二甲基亚砜（DMSO）对照相比，根尖的形状变得不规则且更厚，并且在F-244处理后在根冠处观察到缺陷（图2C）。F-244处理后，根毛减少（图2C，D），F-244对幼苗和根系发育的剂量效应与F-244处理后甾醇的减少很好地对应（图2B；补充表S7和S8）。10 μM和20 μM F-244处理的幼苗的总甾醇含量分别比10 μM F-244处理的幼苗低11%和35%，20 μM F-244处理的幼苗比10 μM F-244处理的幼苗低20%（图2B；补充表S8）。这些结果支持了先前在烟草HMGSOEs中的观察，并证实HMGS可能通过限制甾醇的生物合成而影响烟草幼苗和根系的发育。虽然与野生型相比，OE-wtBjHMGS1和OE-S359A中未发现与植物激素相关的DEP，但与OE-wtBjHMGS1相比，OE-S359A中的BR相关蛋白DWARF1上调（补充表S6）。此外，在OE-wtBjHMGS1和OE-S359A（补充表S1和S2）中发现了一些与发育、细胞组织、分裂和囊泡运输有关的DEP，支持HMGS在幼苗和根系发育中的作用。这些结果表明，在烟草中应用HMGS特异性抑制剂（F-244）是研究HMGS/MVA途径的有效途径。 图2 HMGS抑制剂F-244对烟草幼苗和根系发育的影响 A、烟草幼苗用10或20 μM F-244处理1周前后的图像。B、10 μM和20 μM F-244处理后幼苗鲜重、初生根长和总甾醇含量。C、显微照片在解剖显微镜下显示了F-244处理前后烟草幼苗的根尖。 3. HMGS影响HMGS-OEs和F-244处理的WT烟草的中枢代谢途径 与WT（补充表S1）相比，OE wtBjHMGS1的糖酵解和TCA的DEP不明显，但当OE-S359A与WT进行比较时，我们发现一些乙酰辅酶A和TCA相关的DEP在OE-S359A中表达较低水平（补充表S2）。当OE-S359A与OE-wtBjHMGS1进行比较时，一些糖酵解、乙酰辅酶A、TCA相关的DEP似乎受到影响（补充表S6）。有趣的是，在烟草HMGS OEs中我们发现了一些与细胞壁修饰相关的DEP（补充表S1、S2和S6）。6种细胞壁相关蛋白中有5种在OE-wtBjHMGS1中显著上调（补充表S1）；与WT相比，OE-S359A中五种细胞壁修饰相关蛋白中的四种升高（补充表S2）。当OE-S359A与OE-wtBjHMGS1进行比较时，只有拟南芥EXPANSIN11和甲基酯酶PCR A的烟草等价物在OE-S359A中的表达水平较高，而OE-wtBjHMGS1中其他7种细胞壁修饰相关蛋白的表达水平较OE-wtBjHMGS1低（补充表S6）；这些结果表明HMGS直接参与了细胞壁修饰和纤维素合成。鉴于纤维素是由许多葡萄糖链形成的复杂碳水化合物，上述DEPs蛋白质水平的变化可能导致烟草HMGSoE中糖类的积累和苹果酸的减少（表1），例如，一些糖类，如D-果糖和/或D-葡萄糖在OEwtBjHMGS1中比在WT中增加，并且在OE-S359A中更大程度上增加（表1），而苹果酸在OE-wtBjHMGS1和OE-S359A中下降（表1）。与HMGS-OEs中蔗糖的增加和苹果酸的减少（表1）相反，F-244-OEs中蔗糖含量下降，而苹果酸的积累呈剂量依赖性（表2）。 其次，与氨基酸合成和降解有关的一些蛋白质的水平发生了改变（补充表S1）。与WT相比，OE-wtBjHMGS1中8种蛋白质中的4种增加，包括亮氨酸相关、缬氨酸相关、2种丝氨酸-甘氨酸-半胱氨酸相关蛋白质，而3种天冬氨酸相关蛋白质减少（补充表S1）。当OE-S359A与WT进行比较时，OE-S359A诱导了半醛脱氢酶家族中五种氨基酸相关蛋白中的一种，而其他四种被下调（补充表S2）。当OE-S359A与OEwtBjHMGS1进行比较时，OE-S359A中七种氨基酸相关蛋白中的三种增强（补充表S6）。上述DEPs蛋白质水平的变化引起了烟草HMGS OEs中氨基酸含量的变化（表1），与野生型相比，OE-wtBjHMGS1中L-脯氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸累积，而L-天冬酰胺和谷氨酰胺减少（表1）。这些天冬氨酸和谷氨酸相关的DEP可能导致HMGS OEs中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的降低（表1）。有趣的是，OE-S359A中的Lasparagine低于OE-wtBjHMGS1（表1），而L-天冬酰胺和谷氨酰胺随着WT烟草幼苗中F-244浓度的增加而逐渐积累（表2）。相应地，OE-S359A中甘氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸和Lvaline的含量低于OE-wtBjHMGS1（表1），而F-244（20 μM）处理的幼苗中甘氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸和Lvaline的含量高于F-244（10 μM）处理的幼苗（表2）。这些结果清楚地表明HMGS影响烟草氨基酸代谢。 第三，虽然OE-wtBjHMGS1与WT（补充表S1）相比未鉴定出用于脂质代谢的DEP，但当OE-S359A与WT进行比较时，出现了一些与脂质代谢相关的DEP。七种脂代谢相关蛋白中有五种升高（补充表S2）。当OE-S359A与OEwtBjHMGS1进行比较时，一些脂质代谢相关的DEP似乎受到影响（补充表S6）。OE-S359A诱导了与脂质代谢相关的五种蛋白质中的两种，而不是OE-wtBjHMGS1（补充表S6）。这些DEP蛋白质水平的变化明显改变了HMGS OEs中的脂肪酸组成（表3）。OE-wtBjHMGS1和OE-S359A中某些脂肪酸种类的相对含量，如16:0、18:1（n-9）、18:1（n-11）和18:2显著增加，而16:3、18:3和2-羟基-16:0则减少（表3）。然而，在F-244处理的野生型幼苗中，16:1（n-3）、16:3和18:1（n-11）等脂肪酸种类的相对数量显著减少，而18:0则增加（表4）。虽然16:1（n-3）和18:1（n-11）的脂肪酸种类有所减少，而F-244（20 μM）处理的野生型幼苗中积累的脂肪酸种类比F-244（10 μM）处理的野生型幼苗多（表4），但OE-wtBjHMGS1和OE-S359A之间的脂肪酸组成没有差异（表3），说明OE-S359A对植物生长的促进作用与脂肪酸无关，但HMGS对烟草脂肪酸代谢有一定影响。综上所述，这些结果表明HMGS表达的调节影响糖、苹果酸、氨基酸和脂肪酸的代谢。 表1 20日龄烟草HMGS-OE幼苗碳水化合物、有机酸和氨基酸含量的变化。 表2 21日龄F-244处理烟草幼苗碳水化合物、有机酸和氨基酸含量的变化。 表3 20日龄烟草HMGS-OEs的脂肪酸组成 表4 20日龄烟草HMGS-OEs的脂肪酸组成 4. 在S359A中，Ala359和Ac-CoA之间氢键的消除导致HMGS活性的增加 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）（补充图S4）证实（His）6-BjHMGS1（S359A）是类似于wtBjHMGS1的同型二聚体。S359A与Ac-CoA复合物的整体结构（图3A）与Ac-CoA结合的wtBjHMGS1相似，S359A突变不影响催化残基Cys117、Glu83和His247的结构（图3B）。鉴于HMGS酶促反应的第一步是亲核取代，Cys117的负电荷硫原子预计将与Ac-CoA羰基的碳原子反应，但是Ser359和Ac-CoA中羰基的氧原子之间的氢键使羰基离Cys117更远（图3C）。去除Ala359和Ac-CoA之间的氢键似乎消除了Ser359和Ac-CoA之间的相互作用（图3C），这增加了酶活性，并解释了S359A在体外比wtBjHMGS1更有效的原因。为了测试这种变异（S359A）是否在进化过程中自然发生，我们利用国家生物技术信息中心的工具，以BjHMGS1片段（25个氨基酸残基与S359相邻）为探针，分析了50个其它具有代表性的植物HMGS序列 (https://blast.ncbi.nlm./blast.cgi) 欧洲生物信息研究所(https://www./Tools/msa/clustalo/)，结果表明，S359在所有这些序列中都是保守的（补充图S5），这表明变异并不自然存在。 图3 S359A与乙酰辅酶A复合物的整体结构 乙酰辅酶A（Ac-CoA）和氨基酸以颜色编码键显示，红色表示氧，黄色表示硫，蓝色表示氮，金色表示碳。（A）带有Ac CoA的S359A结构（用青色标记）的前视图和后视图。Ac CoA由箭头表示。（B）放大Ac-CoA连接的S359A的活性位点。（C）青色标记的S359A结构中的Ala359与绿色标记的wtBjHMGS1结构中的Ser359（PDB代码2FA3）和蓝色标记的EfHMGS结构中的Ser308（PDB代码2HDB）的比较。 结论 HMGS介导的促进植物生长的分子机制通过多种组学和抑制剂处理方法进行了研究（图4）。HMGS或S359A在下游类异戊二烯生物合成和初级代谢中过度表达上调蛋白，导致更好的生长和加速发育。本研究的结果证实了HMGS在幼苗和根系发育中的重要作用，也通过使用HMGS的特异性抑制剂F-244（图2）。此外，本研究还发现了一些与HMGS相关的新蛋白，将HMGS/MVA途径与中枢代谢途径联系起来（补充表S1、S2和S6），并确定了HMGS作为初级代谢产物生物合成代谢流量控制的新靶点的调节作用。HMGS对蛋白质组学分析揭示的中枢代谢途径的影响通过对烟草HMGS OEs和F-244处理的野生烟草幼苗中碳水化合物、有机酸、氨基酸和脂肪酸组成的代谢物分析得到证实（表1-4）。此外，对乙酰辅酶A配体S359A晶体结构的阐明表明S359A如何提高HMGS活性（图3）。因此，S359A过表达导致中央代谢途径（糖酵解/TCA/丙酮酸代谢、脂肪酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成）中蛋白质的更高表达（补充图S1；补充表S1和S2），导致比OE-wtBjHMGS1更有利。总的来说，本研究揭示了HMGS将MVA途径与调控植物生长的中枢代谢途径联系起来，为SWATH-MS在烟草蛋白质组学分析中的应用提供了一个范例，并展示了F-244在烟草幼苗中的应用。 |
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