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编译：Sophie，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 两面针（Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC）的干燥根在中医药治疗类风湿关节炎、牙痛、胃痛、瘀伤、蛇咬伤等方面有着广泛的应用。生物碱含量，特别是氯化两面针碱（NC），是药草质量的重要指标。现在药草市场上出现了滥用两面针的植物源的现象，如使用不符合《中国药典》规范的NC含量等。因此，对5省35个产地的野生样品进行了分布调查，包括形态和植物化学差异（3种生物碱、1种类黄酮和1种木脂素）的评估。被调查的植物分为4种类型：3个品种（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）和1个变种（Ⅳ型）。大多数Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类植物的NC含量符合质量标准，而广西的3个Ⅳ类植物的NC含量均较低，应慎重利用该地区的植物。为了确定NC和其他活性化合物的生物合成途径，本研究用9个Ⅲ型转录组（根、茎和叶，每个组织3次重复）和3个Ⅰ型转录组（3次重复）挖掘候选unigenes。共鉴定出505386个unigenes，平均长度866bp。用组织表达模式的共表达分析来缩小候选基因的范围。筛选出23个参与生物碱生物合成途径中的候选unigenes，38个参与木脂素生物合成途径的unigenes，16个参与类黄酮生物合成途径的unigenes。本研究所进行的分布调查、植物化学及转录组学分析，为两面针资源保护和分子育种提高产品品质提供了有价值的见解。 论文ID 原名：Distribution survey, phytochemical and transcriptome analysis to identify candidate genes involved in biosynthesis of functional components in Zanthoxylum nitidum 译名：通过分布调查、植物化学和转录组分析鉴定参与两面针功能成分生物合成的候选基因 期刊：Industrial Crops & Products IF：4.191 发表时间：2020.03 通讯作者：郭巧生 通讯作者单位：南京农业大学中药材研究所 DOI号：10.1016/j.indcrop.2020.112345 实验设计 本研究的试验材料为采自广东、广西、福建、浙江、海南等产地的35份野生两面针。将样品根系过50目筛，用100 mL甲醇萃取，加热回流90分钟，提取物保存在4°C下，过滤提取物的上清液用于超高效液相色谱法（UPLC）分析，同时测定5种活性化合物。在Illumina-HiSeq-4000平台上，对Z5的叶片和Z12的根、茎、叶进行RNA-seq，从头组装转录组并对基因进行功能注释，分析功能成分的生物合成途径。用每个组织中4个P6H unigenes的FPKMs构建聚类算法，用于筛选参与两面针白屈菜红碱和NC生物合成途径中候选unigenes；从每个组织中的34个unigenes中选择4个FPKMs较高的类黄酮UDP葡萄糖基转移酶候选基因建立聚类算法，筛选与两面针中苦橙甙生物合成途径有关的候选unigenes；从每个组织的32个unigenes中筛选出5个FPKMs较高的DIRs蛋白，创建聚类算法，来筛选参与芝麻素生物合成途径的候选unigenes。 研究内容 1 两面针的植物形态及地理分布 根据35份野生植物样品的植物学特征，将其分为4类。9个为Ⅰ型（革质叶，具翼状多刺的树干），3个Ⅱ型（纸质叶，具星状皮孔的无刺茎），20个Ⅲ型（纸质叶，具钉状多刺的茎），3个Ⅳ型（叶背面多毛）（表1和图2）。 在中国植物志中，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ是最早命名的Z. Nitidum var. Nitidum（两面针原变种）。Ⅳ型（Z. nitidum (Roxb.) DC. var. tomentosum Huang）是毛叶两面针的变种。4种类型两面针的地理分布如下。在我国，Ⅰ型植物比其它三种类型分布得更北。Ⅱ型植物在海拔108-729 m地区广泛分布。Ⅲ型（占57.14%）是野生资源最丰富的类型。多毛突变发生在Ⅳ型叶片上，这可能是适应高海拔（914 m）的生长。 表1 材料的产地、类型、海拔、纬度和经度。 图2 五种活性成分含量热图和四种类型两面针的形态差异。共35个两面针样品分为4种类型（Ⅰ型，9个样品；Ⅱ型，3个样品；Ⅲ型，20个样品；Ⅳ型，3个样品）。II型、III型和IV型分别表现出最高的木兰碱、NC和苦橙甙含量。Ⅰ型和Ⅲ型的白屈菜红碱含量相似。Ⅱ型芝麻素含量最低。 2 检测3种生物碱、1种类黄酮和1种木脂素 采用UPLC法同时检测3种生物碱（白屈菜红碱、NC和木兰碱）、1种黄酮类化合物（苦橙甙）和1种木脂素（芝麻素）。混合标准品和试验样品的代表性总离子色谱图如图1B所示。五种生物活性成分都被分离出来，此方法可以用来定量。木兰碱测定方法的线性关系良好（r = 0.9999）和回收率较高（105.64％），其他四个组分也获得了相似的结果。 图1（A）两面针中五种活性成分的化学结构。（B） 混合标准品的色谱图和使用UPLC的代表性试验样品之一。 35个野生样品中的5种化合物如图2和表2所示。在毛叶两面针（Ⅳ型）中未发现白屈菜红碱。NC在Ⅲ型植物中含量最高，在Ⅳ型植物中最低。Ⅱ型植物的木兰碱含量高于其它类型植物。在4种类型两面针中，苦橙甙含量范围为0.09-14.49 mg/g，IV型的苦橙甙含量最高。Ⅱ型植物的芝麻素含量最低（0.06 mg/g），Ⅲ型植物的最高（3.09 mg/g）（表2）。 表2 四种类型两面针中五种活性成分的百分比。 3 转录组数据统计、组装、评估和功能注释 对转录组数据进行质量控制后，在两面针的叶、茎和根中分别生成13.2、15.8和14.8Gb的clean data。Clean data的Q20超过95.85%，叶、茎和根的GC含量分别为43.73、43.73和43.51。这些结果表明，clean data reads质量高，数据足够可靠，可用于后续分析。利用Trinity获得815926个从头组装的contigs，平均长度644bp，N50为943bp。此外，这些contigs被聚集成505386个unigenes，平均长度866bp，N50为1147bp。 使用7个数据库（Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swissprot、KEGG和GO）对unigenes进行注释。在505386个unigenes中，其中379355个（75.06%）至少在一个数据库中被成功注释，39060个（7.72%）在所有数据库中被注释。但是，24.94%的unigenes是未知的，这表明有些unigenes可能是两面针所特有的。 基于序列同源性，196729个unigenes富集在三大GO类别和56个亚类中。在26个生物过程中，这些unigenes主要富集在细胞代谢和单有机体过程。在细胞组分中，这些unigenes富集在细胞亚类、细胞部分、细胞器和大分子复合物。在分子功能中，这些unigenes主要参与结合和催化活性（图3A）。 图3 （A）两面针GO注释直方图。基因富集在三大类：生物过程、细胞成分和分子功能。（B）两面针unigenes KEGG分类。A，细胞过程；B，环境信息处理；C，遗传信息处理；D，代谢；E，组织系统。#表示代谢过程，&表示催化活性，*表示其他次生代谢物的生物合成包括生物碱和类黄酮代谢。 用KOG数据库将75672个unigenes分为26个功能类别，其中最主要的是参与翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣的功能类别（11022个unigenes）。其次是一般功能预测、翻译、核糖体结构和生物发生（8427个unigenes）（图3B）。 KEGG分析可用于检测代谢过程中的基因产物，确定它们在细胞过程中的假定功能。在这些unigenes中，其中104378个富集到KEGG数据库，包括参与细胞过程、遗传信息处理、环境信息处理、新陈代谢和组织系统的19个生物途径。大多数unigenes主要参与碳水化合物代谢（12682个unigenes），其次是翻译（12131个unigenes），以及折叠、分类和降解（10045个unigenes）。 4 候选基因筛选 4.1 两面针中白屈菜红碱、氯化两面针碱和木兰碱的生物合成途径 (S)-牛心果碱已被报道是生物碱生物合成途径中木兰碱和白屈菜红碱的中间产物。分析两面针转录组发现，8个unigenes可能编码(S)-乌药碱N-甲基转移酶（CNMT），1个unigenes编码(S)-N-甲基乌药碱3′-羟化酶同工酶2（CYP80B2），32个unigenes编码(S)-去甲乌药碱合成酶（NCS）。但是，没有编码紫堇块茎碱合成酶（CYP80G2）和牛心果碱N-甲基转移酶（RNMT）的unigenes。在白屈菜红碱生物合成过程中观察到26个编码牛心果碱氧化酶（BBE1）的unigenes和4个编码原阿片碱6-羟化酶（P6H）的unigenes（图4）。两面针的NC质量控制标准已载入《中国药典》。白屈菜红碱和NC的化学结构在氯含量上存在差异，推测氯化物过氧化物酶（CPO）的三个unigenes参与了NC的生物合成。 图4 两面针中白屈菜红碱、氯化两面针碱和木兰碱的生物合成途径。NCS，(S)-去甲乌药碱合成酶；6OMT，[RS]-去甲乌药碱6-O-甲基转移酶；CNMT，（S）-乌药碱N-甲基转移酶；CYP80B2，（S）-N-甲基乌药碱3’-羟化酶同工酶2；HNCOMT，3’-羟基N-甲基-（S）-乌药碱4’-O-甲基转移酶；CYP80G2，紫堇块茎碱合成酶；RNMT，牛心果碱N-甲基转移酶；BBE1，牛心果碱氧化酶；P6H，原阿片碱6-羟化酶；CPO，氯化物过氧化物酶。红色标记的基因和数字表示在转录组数据中注释到相应基因功能的unigenes数目。 本研究鉴定了参与生物合成途径的所有基因的FPKMs，并进行了聚类比较。共有74个unigenes参与了白屈菜红碱和NC的生物合成途径。用每个组织中4个P6H unigenes的FPKMs构建聚类算法，筛选两面针中参与白屈菜红碱和NC生物合成途径的候选unigenes。共筛选出23个候选基因，包括4个CNMT unigenes、1个CYP80B2 unigene、3个NCS unigenes、8个BBE1 unigenes、4个P6H unigenes和3个CPO unigenes。候选基因聚类比较结果如图5所示。3个CPO unigenes与CYP80B2和CNMT-1紧密聚簇。 4.2 两面针中苦橙甙和芝麻素生物合成途径 苦橙甙和芝麻素都是通过苯丙酸途径形成的。在两面针转录组中，共观察到27个可能编码苯丙氨酸解氨酶（PAL）的unigenes，8个编码反式肉桂酸4-单加氧酶（C4H）的unigenes和91个编码4-香豆酸脂-CoA连接酶（4CL）的unigenes。4-香豆酰基CoA是黄酮类化合物（苦橙甙）和木脂素（芝麻素）生物合成途径的分支。相关的unigenes数目如图6所示。在本研究中，从两面针的转录组数据中筛选了12个可能编码类黄酮4′-O-甲基转移酶（FOMT）的unigenes，34个类黄酮UDP-葡萄糖基转移酶（类黄酮UGT）的unigenes和5个类黄酮鼠李糖基转移酶（类黄酮RT）的unigenes。 图6 两面针中苦橙甙和芝麻素生物合成途径的研究。实心箭头表示已在其他植物中报道的途径。虚线箭头表示假定的路径。PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，反式肉桂酸4-单加氧酶；4CL，4-香豆酸-CoA连接酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查尔酮异构酶；F3’H，类黄酮3’-羟化酶；FOMT，类黄酮4’-O-甲基转移酶；类黄酮UGT，类黄酮UDP-葡萄糖基转移酶；类黄酮RT，类黄酮鼠李糖基转移酶；C3H，p-香豆酸3-羟化酶；CCoAOMT，咖啡酰CoA O-甲基转移酶；CCR，肉桂酰CoA还原酶；CAD，肉桂醇脱氢酶； CYP，细胞色素P450。红色标记的基因和数字表示在转录组数据中注释到相应基因功能的unigenes数目。 除了参与最后一步的细胞色素P450，几乎所有的酶都在两面针中被发现（图6）。总共219个和117个unigenes被推测分别参与苦橙甙和芝麻素的生物合成途径。基于每个组织中unigenes表达模式的聚类算法，筛选出高FPKMs的4个类黄酮UGT和5个DIR unigenes（特别是在根中）（图7）。5个类黄酮RT unigenes与CHS-4、CHI-5和F3′H紧密聚集（图7A）。2个CCoAOMT unigenes、5个CCR和4个CAD可能是参与木脂素和芝麻素生物合成的关键基因（图7B）。
图7 （A）参与两面针苦橙甙生物合成途径候选基因的表达谱分析。从每个组织的34个unigenes中选择FKPM较高的4个类黄酮UGTs构建聚类算法，来筛选参与两面针中苦橙甙生物合成途径的候选unigenes。（B）参与两面针芝麻素生物合成途径候选unigenes表达谱分析。从每个组织的32个unigenes中选择FKPM较高的5个的DIR构建聚类算法，来筛选参与芝麻素生物合成途径相关的候选unigenes。 讨论 以前对两面针的资源调查大多在广西和广东省进行。本研究调查了广西、广东、海南、浙江、福建等省两面针的野生分布。共调查了35个野生两面针样品，分为4个类型：3个品种（I、II、III型）和1个变种（IV型）。其中Ⅲ型植物最为丰富，占样品总数的一半以上，主要分布在广东省11个区、广西6个区、海南3个区。在20个III型两面针中，18个符合《中国药典》（2015年版）中的质量控制标准。所有II型两面针和三分之二的I型两面针均符合中国药典的要求。但是，在广西省的3个IV型植物的NC含量比质量控制标准低3倍。因此，应该优先保护两面针I、II、III型的种质资源。 目前还没有一种检测两面针中生物碱、类黄酮和木脂素的方法。本研究中，通过UPLC法同时测定了5种活性成分，即3种生物碱（木兰碱、NC和白屈菜红碱）、1种木脂素（芝麻素）和1种黄酮类化合物（苦橙甙）。在4种类型中，Ⅲ型植物表现出最高的NC、白屈菜红碱和芝麻素含量，表明Ⅲ型植物具有最好的综合特性。但是，在毛叶两面针中没有检测到白屈菜红碱。IV型植物的NC含量最低。因此应该高度重视此类型两面针的使用。 NC是一种来源于两面针的生物碱，起到抗癌和抗炎作用。本研究采用转录组学和植物化学方法鉴定参与生物碱生物合成的候选基因。白屈菜红碱是NC的前体物质，已在苹果中发现并通过基因组测序阐明了其生物合成途径。从化学结构上看，白屈菜红碱和NC的氯（Cl）存在差异。大多数CPO酶都是在微生物中发现的，但在两面针中发现了3个CPO候选unigenes。据悉，被子植物中的CPO基因除了两面针外几乎没有人知道，这为研究CPO基因的进化和植物的多样性提供了潜在的线索。 人类和动物研究中表明，苦橙甙（又叫橙皮苷）可以调节抗氧化和炎症状态，改善有氧运动。圣草酚，是苦橙甙生物合成的中间物质，具有抗氧化活性。在两面针中，有12个unigenes可能编码FOMT，是橙皮素（4’-O-甲基-圣草酚）合成的关键基因。两面针根中也含有一定的苦橙甙（橙皮苷），但是苦橙甙的生物合成尚不清楚。本研究中，类黄酮UGT的34个unigenes和类黄酮RT的5个unigenes明显参与了两面针苦橙甙途径的最后两个步骤，为阐明完整的途径提供了基因资源。本研究发现的与两面针次生代谢物生物合成有关的unigenes，可用于高活性成分的分子标记辅助育种。 结论 更多推荐 1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
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