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编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 小细胞肺癌（SCLC）是神经内分泌肿瘤，临床上预后差。不同的SCLC分子表型基于ASCL1、NEUROD1、POU2F3以及YAP1的表达已经确定。在本文中研究者利用小鼠和人的模型进行时间序列单细胞转录组分析，结果发现MYC驱动SCLC亚型的动态进化。在神经内皮细胞中MYC活化Notch信号通路使肿瘤细胞去分化，促进SCLC中ASCL1+到NEUROD1+到YAP1+的瞬时转化。MYC能够选择性促进不同细胞类型中POU2F3+的肿瘤。人类SCLC表现出肿瘤内亚型的异质性，提示这一动态的进化发生在肿瘤内。这些结果提示基因、细胞起源以及肿瘤细胞的可塑性决定了SCLC的亚型。 论文ID 原 名：MYC Drives Temporal Evolution of Small Cell Lung Cancer Subtypes by Reprogramming Neuroendocrine Fate 译 名：MYC通过重编程神经内分泌驱动小细胞肺癌亚型的时间演化 期刊：Cancer Cell 影响因子：26.609 发表时间：2020年7月13日 作者：Trudy G. Oliver 单位：犹他大学 DOI：10.1016/j.ccell.2020.05.001 前言 小细胞肺癌（SCLC）被认为是单一的无区分的疾病，其表现出对肿瘤抑制因子RB1和TP53基因缺失，并且无一例外的突变表达MYCL、MYC、MYCN。对人类肿瘤和细胞系的大规模基因表达分析提示SCLC由基于线性转录因子表达的四类不同的分子亚型构成，包括ASCL1 (SCLC-A)、NEUROD1 (SCLC-N)、POU2F3(SCLC-P)、YAP1 (SCLC-Y)。研究表明SCLC亚型具有特异的治疗弱点，强调了解析这些亚型在临床上的重要性。SCLC分子亚型的起源和关联目前尚不明确。 SCLC-ASCL1亚型构成了人类SCLC的70%。ASCL1是神经内分泌（NE）的主要调节因子，是肺NE细胞（PNEC）发育所必需的并且标记成人的PNECs。成人PNEC是多样的Rb1/Trp53 (RP)-null基因加工的SCLC小鼠模型中ASCL1+肿瘤细胞的来源。在这些GEMMs中ASCL1对于肿瘤的发育至关重要。MYCL在SCLC-A亚型中扩增或者高表达对于SCLC-A的发育是必需的。相反，其他三种SCLC亚型代表了30%的肿瘤(SCLC-N, SCLC-P, SCLC-Y)倾向于扩增或者过表达MYC，并且表现出低的或者没有NE的细胞命运。研究者发现Myc表达驱动RP GEMMs和表达NEUROD1肿瘤中没有NE的SCLC表型。然而，SCLC-A和SCLC-N之间的关系以及是否MYC能够驱动SCLC-P或者SCLC-Y的表型尚不明确。 Notch信号通路调节PNEC命运以及具有二分功能的SCLC的肿瘤发生。在SCLC中Notch作为肿瘤抑制因子，在Notch受体中有25%的肿瘤坐落在丧失功能的突变上。在肺损伤过程中，Notch2标记一类NE干细胞的群体，能够在Notch活化丧失后进行自我更新。在Rb1和TP53丧失中丧失Notch功能假定将细胞锁定在自我更新的NE干细胞样状态，从而促进SCLC。然而Notch在人类SCLC的一个亚群中活化并且Notch的活化能够促进非NE的SCLC的命运。此外，在肺损伤中未知的信号活化Notch信号通路促进了NE干细胞向非NE命运的短暂扩增以及去编程。而MYC和NOTCH在SCLC中对非NE细胞的命运是非常重要的，在这一背景下MYC和NOTCH的功能关联尚不明确。研究者探究了在SCLC分子亚群起源和关联中MYC发挥的功能。 结果 为了确定哪个SCLC分子亚型是由MYC促进的，研究者分析了MYC(Rb1fl/fl;Trp53fl/fl; Lox-Stop-Lox [LSL]-MycT58A, RPM)以及MYCL(Rb1fl/fl;Trp53fl/fl;Rbl2fl/fl, RPR2)驱动的SCLC GEMMs。研究者利用腺病毒-Cgrp 启动子-Cre 病毒(Ad-Cgrp-Cre)特异的转化PNECs。在RPM和RPR2模型中早期的原位损伤能够高表达NE的标记物，包括SCL1, SYP, CGRP,UCHL1, DLL3（图1A、1B和S1B）。转移的RPR2肿瘤维持高NE的名媛，而转移的RPM肿瘤能够显著降低NE的标记物表达（图1A、1B、S1B）。人类SCLC细胞系中整体的基因表达数据显示Myc, Notch/Rest, Hippo/Yap1以及EMT信号通路与SCLC中非NE命运相关。研究者分析了SCLC亚型中的标记物以及RPM和RPR2肿瘤中非NE命运的一组标记物表达。在转移的RPM肿瘤中获取了非NE标记物的表达，包括NEUROD1,YAP1, HES1, ZEB1, 以及CD44（图1C、1D、S1B）。在原位以及转移的RPM肿瘤中MYC高表达，但是在RPR2中并未检测到（图S1B）。有趣的是，POU2F3很少在RPM肿瘤中检测到（图1E），然而在(Ad-CMV-Cre)的RPM小鼠中肿瘤起始，POU2F3的表达富集（图1E、1F、S1C）。POU2F3在Mycl相关的RPR2肿瘤中并未检测到（图1E）。POU2F3+的肿瘤分析发现约44%的缺乏SCLC亚型标记物的表达，而大多数的肿瘤表达POU2F3和NEUROD1（图1G、1H）。在POU2F3+肿瘤中表达其他亚型标记物的细胞比例很少（少于16%）（图1G、1H）。这些数据提示MYC驱动的SCLC-P肿瘤从未知的细胞起源而不是PNEC、club细胞或者AT2细胞，并且MYC能够促进SCLC-P的发育。由于POU2F3是簇细胞的主要驱动因子，确定是否MYC驱动的SCLC-P肿瘤来自于簇细胞是未来研究必需的。 总之，这些结果提示在Rb1和TP53缺失的背景下，MYC促进SCLC-N和SCLC-Y的分子亚型。此外在PNECs中MYC驱动从一个NE高水平到无NE表型的SCLC发展。这些结果与MYC在人类SCLC-N, -Y, -P亚型中富集一致，并且说明MYC是这些SCLC分子亚型在体内的驱动因子。 图1 MYC驱动体内多样的SCLC分子亚型 MYC在体外驱动SCLC亚型的进化 肿瘤组织学静态观察限制了SCLC亚型间潜在的短暂联系。为了解释这一观点，研究者宏观解剖Ad-Cgrp-Cre-感染RPM小鼠肺的中心部分（图2A），研究者将分离的细胞悬浮培养3-4天发现肿瘤细胞大量集簇生长（图2B）。肿瘤细胞最初是紧致的圆球集合，代表着经典的高表达NE的人类SCLC细胞系（图2B、2C），但是最终形成无定形的集簇链环形态，代表着变异的非NE人类SCLC细胞（图2B、2C、S2A）。这一严重的转变超过20天后再次发生，这与RPM GEMM模型中SCLC从早期到转移的发展时间是一致的。重要的是，RPR2肿瘤细胞的早期阶段在培养过程中维持一个经典的形态（图2B、S2A）。 为了描述RPM肿瘤细胞的转换，研究者在培养的多个时间点手机了RPM肿瘤细胞并且评估了SCLC亚型的标记物。培养5天的细胞表现出高的NE水平，由ASCL1和NE标记物的表达标记（图2D）。NEUROD1在5-12天时瞬时表达，伴随非NE标记物REST,YAP1, NOTCH2, N2ICD以及HES1在10-24天的表达。在RPR2细胞中异源表达MycT58A-Ires-Gfp能够导致松散的集簇或链条引起非NE标记物的表达。这些发现提示高水平的NE到非NE的转换并不是长期培养的结果。 为了验证MYC对于改变肿瘤细胞命运是否充裕，研究者在NE高水平且MYCL相关的经典细胞系中表达了MycT58A-Ires-Gfp。异源表达的MYCT58A将细胞形态从经典改变为突变样的形态，导致非NE标记物的表达（图2E、2F）。MYC异源过表达水平少于MYC高表达的SCLC细胞和RPM肿瘤（图S2E），提示这一表型不是由于MYC的超生理水平。NEUROD1表达并未在这些实验中检测到（图2E、S2C），提示NEUROD1表达并不是早期瞬时的，并且在NEUROD不表达的情况下，YAP1的表达可能是由MYC引起的。尽管非NE标记物表达和突变形态的获得是由MYC引起的，小鼠和人类MYC表达的细胞限制了一些NE标记物的表达，包括ASCL1（图2E、S2C），提示是异质的群体或者NE和非NE细胞的混合存在。总之，这些数据证实MYC能够促进非NE肿瘤细胞的命运，以及从SCLC-A到SCLC-Y的亚型进化。 图2 MYC驱动体外SCLC亚型的进化 人类SCLC与MYC驱动的进化相符 接下来研究者探究了在人类SCLC肿瘤中MYC 驱动的肿瘤进化的转录状态。研究者对Ad- Cgrp-Cre-感染小鼠中8个时间点的RPM肿瘤细胞进行了整体的RNAseq。NE和非NE信号通路基因的分析证实NE短暂缺失以及随后获得的非NE信号通路，包括Notch/ Rest, Hippo/Yap1, 以及 EMT（图3A、S3A）对25个NE和25个非-NE相关基因进行GSEA分析发现MYC能够促进从NE到非NE转录状态的转变（图3B、S3A）。在转变过程中观察到了对亚型确定的转录因子Ascl1、Neurod1、Yap1等的动态和连续表达（图3C）。与RPM肿瘤中POU2F3缺乏一致的是研究者观察到了在转变过程中Pou2f3的mRNA水平极其低（图3C）。 为了确定在人类肿瘤中亚型确定的转录因子表达是否与基因表达图谱相关联，研究者依据分子表型收集了81个人类SCLC肿瘤和51个人类SCLC细胞系的整体RNAseq数据（图S3B）。利用每个亚型中表达最高的基因进行人类SCLC亚型特异基因图谱（表S1），并且利用GSEA确定了在RPM转变时期富集或者缺失的基因特则恒（图3D）。与转录因子表达图谱（图3C）一致的是，3-5天和7-10天的细胞在人类SCLC-A和SCLC-N中富集，而在SCLC-Y中缺失。相反的是，在14-21天时在SCLC-Y中富集而在SCLC-A和SCLC-N中缺失，证实了在小鼠中MYC驱动肿瘤细胞进化与人类肿瘤亚型确定的转录图谱是一致的。研究者确定了在RPM肿瘤细胞中Rb1和TP53是调配的。对RPM肿瘤细胞的早期和晚期时间点进行全基因组分析证实在Rb1和TP53的期望区域是完全缺失的并且没有检测到拷贝数的变化（图S3E、S3F）。上述结果证实在体外MYC驱动肿瘤细胞进化反映了RPM GEMM中表型的瞬时改变，确定了四个人类SCLC亚型中的三个沿着MYC驱动的轨迹从SCLC-A到SCLC-N到SCLC-Y。 图3 人类SCLC亚型与MYC驱动进化相符 MYC驱动SCLC亚型沿着单一的进化轨迹进行 为了进一步确定在MYC驱动SCLC进程中转录的变化，研究者进行了单细胞RNA-seq（scRNA-seq）。研究者分离了RPM-Rosa26-LSL-Cas9-Ires-Gfp (RPM-Cas9)小鼠中未分类的早期肿瘤细胞，它们停留在4-21天的六个不同的时间点（图4A）。每个时间点大约捕获4-8000个细胞（细胞综述31519）。4-7天的细胞由肿瘤细胞和非肿瘤细胞构成并且在培养的11天非肿瘤细胞缺失（图4A）。为了进行下游分析，非肿瘤细胞和低质量细胞被过滤掉，由于细胞周期基因退化导致基因表达的微小突变也被去除。基于高表达基因对肿瘤细胞进行无差别的tSNE聚类分析发现至少三个不同的聚类与4-7天、11天、14-21天对应（图4B）。在4-7天聚类的细胞高表达Ascl1和NE的标记物，在11-21天的细胞大部分缺失，替代的是高表达的非NE标记物（图4C）。尽管研究者仅捕获了一小部分表达Neurod1细胞，这些细胞聚类在NE高表达的细胞中（图S4C）。 接下来研究者在四个转移的RPM-Cas9肿瘤中进行了scRNA-seq，一个主要是ASCL1-高表达（RPM1）三个NEUROD1和YAP1的表达是变化的（RPM2-4）。将RPM转换点和肿瘤样本结合，研究者构建了伪时序轨迹以确定肿瘤细胞中预测的转录关系。无差别的伪时序预测了从早期到晚期对应的线性轨迹（图4D-4F）。多面伪时序轨迹证实RPM肿瘤细胞沿着同一轨迹进程，大部分的细胞在伪时序的最早起，只有少数进入后期阶段（图4D）。RPM2-4肿瘤在晚期时间点的细胞要多于RPM1，与它们较低ASCL1的水平和较高的YAP1蛋白表达一致（图4D、S4D）。 Ascl1, Neurod1和Yap1的表达与MYC驱动短时进化一致，而Pou2f3很少被检测到（图4E）。Mycl在早期时间点与Ascl1表达相关，并且在肿瘤细胞进程中缺失（图4E），这与ASCL1和MYCL在化疗自然SCLC中协调表达并且在放疗SCLC中降低一致。围绕伪时序前500个差异表达的基因表达证实通过获得非NE基因有大量的NE基因缺失（图4F、表S2）。 研究者利用4天Ascl1高表达的细胞对伪时序的晚期发挥作用（图4D、S4F），这些细胞中仅一个集簇在tSNE空间伴随晚期肿瘤细胞（图S4F、S4G），提示这些细胞在转录水平与肿瘤细胞早期和晚期并不相同。利用正交方法预测细胞轨迹，研究者利用弥散图证实从早期、NE高水平到晚期和非NE细胞转态的相似细胞内轨迹（图S4H）。弥散成分DCs在培养中最佳的分布时间点确定了弥散伪时序的基本轨迹（图S4I）。弥散的伪时序将4天的一部分细胞放在晚期（图S4J），但这些细胞与其他细胞存在转录水平的差异（图S4K）。弥散分析也证实一些特征如DC6和DC4。单核弥散图谱伪时序也是正相关的。综上，伪时序分析与研究者的数据一致，提示MYC驱动SCLC从NE到非NE的短时进化。 图4 MYC驱动SCLC亚型沿单一进化轨迹进展 MYC驱动的小鼠肿瘤表现出肿瘤内分子亚型的异质性 伪时序分析提示单独的RPM肿瘤由代表多样的SCLC分子亚型构成（图4D、4E）。为了更全面的检测研究者分析了单独的RPM肿瘤在原位和转移的亚型标记物（图5A、5B）。在原位肿瘤中主要是ASCL1+，并且有单一的分子亚型标记物（~87%）。相反转移的肿瘤主要由2-3个亚型，要么是ASCL1和NEUROD1，或者是所有三个分子亚型(ASCL1, NEUROD1,YAP1)。对额外10个RPM肿瘤进行CIBERSORT分析也预测了MYC驱动各个阶段肿瘤内的异质性（图5C）。对RPM肿瘤的scRNA-seq分析提示这些标记物基于Ascl1和Neurod1在每个细胞中微量共表达（图5D），这与在伪时序中它们之间的紧密联系一致。在这些肿瘤中Ascl1, Neurod1, Yap1的丰度也与整体的RNA-seq和蛋白分析一致（图5B-5D）。对RPM肿瘤转换的scRNA-seq分析也说明Ascl1, Neurod1,Yap1之前重叠的很少（图5E），11-21天的细胞代表肿瘤的晚期。因此，单独的方法提示MYC驱动体内多样的SCLC亚型的进化。 图5 MYC驱动小鼠肿瘤表现出肿瘤内分子亚型的异质性 MYC通过NE去分化活化Notch信号通路 为了发现与MYC驱动肿瘤细胞进化相关的转录图谱，研究者利用scRNA-seq的数据进行了差异基因表达分析（图6A）。在主要细胞集簇（4-7天vs11天vs14-21天）的差异较大的基因进行ENRICHR分析，确定了对SCLC命运重要的转录因子（图6B），包括REST,SUZ12, TCF3, NEUROD1, NHLH1, MYC, SOX2。由于Notch/ Rest信号通路能够促进SCLC中非NE命运，且REST是MYC促进早期变化的第一个调节因子，研究者聚焦于NE表型开关。利用表3中对人类衍生NE分值载体，研究者在RPM时间系列和整体肿瘤了中分配每个细胞一个NE分值（图6C）。NE分值准确预测了NE分值在7-11天降低（图6D）。 为了确定MYC如何在机制水平上促进转换，研究者在转移的RPM肿瘤中进行了MYC的ChIP-seq，前50个上调的基因在MYC高表达vsMYC低表达的人类SCLC中富集。应用MYC-ChIP分子发现11天前MYC表达有小的但是显著上升，证实了ENRICHR的预测（图6B）。这些分析提示7-11天代表转变的状态，由 NE的减少和MYC的高活性定义。 研究者由于观察到Notch/Rest信号通路，分析了Notch-相关机制的表达和转变过程中的靶基因。Notch抑制因子的表达在早期时间点升高（图S5B、S5C），包括抑制的Notch配体基因Dll3, Hes6, Fbxw7, Ncor2。相反，促Notch信号基因表达升高，包括Notch靶基因Hes1、Rest，以及Notch受体基因Notch2（图S5B、S5C）。通过整个RNA-seq对Notch信号通路和REST转录靶基因的GSEA分析揭示晚期Notch信号通路活性升高而REST信号通路抑制。重要的是多个Notch信号通路的成分被确定为MYC的靶基因，包括Notch2, Hes1, Hes6, Jag2（图6F）。与此一致的是，NOTCH2和HES1蛋白水平在多个细胞类型中由MYC引起（图2D、2E、S2C）。促Notch信号通路的基因NOTCH2,HES1,REST同样在MYC高表达的人类SCLC中显著富集（图6G），而Notch抑制的HES6是降低的，提示在SCLC中MYC对Notch信号通路的正调控。综上，这些数据提示在MYC驱动的SCLC进化过程中MYC能够提高NOTCH/REST信号通路的活性使NE去稳定。 图6 在NE重塑过程中MYC活化Notch信号通路 Notch信号通路活化是MYC驱动肿瘤进化所必需的 为了确定Notch信号通路是MYC确定SCLC进化所必需的，RPM肿瘤细胞培养中设置对照组和γ- 分泌酶抑制剂(GSI-IX)以封闭Notch信号通路。与对照细胞相反的是在10天转变为突变的形态，DAPT处理的RPM细胞在20天并未转变为突变的形态（图7A）。Notch封闭提高和延长了ASCL1, INSM1, EPCAM, NEUROD1的表达（图7A、S6A、S6B），相反DAPT处理的延迟或者封闭了非NE标记物的表达（图7B、S6A、S6B）。有趣的是，当添加DAPT到Notch活性的早期RPM肿瘤细胞，研究者观察到非NE标记物的表达，而不是NE标记物的表达。因此，MYC驱动的进化可能不能反转，但仍然需要确定其他非NE相关的信号通路封闭可能反转SCLC到NE的高状态。接下来，研究者用DAPT对RPM早期肿瘤进行处理以在体内封闭Notch信号，通过microCT成像检测10天的肿瘤生长，对照组可生长12天。DAPT处理导致肿瘤负荷显著降低（图7C）。H&E-组织染色发现DAPT处理使肿瘤的负荷显著降低（图7D）。DAPT处理的RPM肿瘤表现出经典的形态增多，更小的细胞具有更大的核质比并且通过ASCL1和DLL3水平确定NE显著增（图7E、7F），此外，DAPT处理的肿瘤NEUROD1和YAP1的表达降低而显著降低肿瘤的进程。研究者并未检测到HES1表达的异常，由于在这些时间点的对照组肿瘤中HES1水平已经很低（图7E、7F）。MYC水平在两个处理组中很高，超过90%的细胞对MYC正相关，提示Notch抑制对细胞命运的影响不是由于MYC水平的降低。对肿瘤RPM小鼠进行第二Notch抑制剂(dibenzazepine)处理也发现肿瘤的负荷显著降低，但是在7天由于高度的毒性限制了分析（图S6D、S6E）。总之这些结果提示抑制Notch能够显著抑制MYC驱动的肿瘤进程。 NOTCH突变体功能丧失发生在25%人类SCLC中，无一例外的突变发生在NOTCH1, -2, -3, -4中。研究者假说MYC需要完整的NOTCH驱动SCLC亚型的进化。利用发表的NOTCH突变体功能分类，研究者将人类SCLC肿瘤和细胞系进行分类为野生型（WT）或者沉默型、未损伤的或者损伤的。与假说一致，MYC的表达在NOTCH WT或者沉默的突变体中显著升高（图7G）。所有MYC高表达的SCLC样本（n =30）有完整的NOTCH（图7G）。一些MYC表达的肿瘤具有完整的NOTCH表现出低的NE分值，而所有NOTCH损伤的突变体肿瘤NE高水平（图7G）。研究者挖掘了数据库(SCLC_CellMiner)中的细胞系，选取了50个额外的SCLC细胞系进行相似的分析（图7H），在MYC高表达的NOTCH WT vs NOTCH突变体的样本中在质量和比例上发现的显著差异是NE低水平。这与研究者的模型MYC通过活化NOTCH信号通路促使非NE进程。GSEA分析提示Notch信号通路和MYC的活性在NOTCH WT人类SCLC中富集（图7I、表S4）。总之，这些结果提示MYC依赖NOTCH促进NE去分化并且NOTCH封闭能够抑制MYC驱动的肿瘤发展。 图7 Notch信号通路活化是MYC驱动肿瘤分子亚型所必须的 人类SCLC表现出肿瘤内分子亚型的异质性 研究者试图确定人类SCLC肿瘤和细胞系整体的RNA-seq数据中RPM时间点的基因特征。CIBERSORT分析发现大多数人类肿瘤具有MYC驱动肿瘤多个阶段的细胞，不管它们经典的SCLC亚型（图8A）。肿瘤上的细胞大多代表NE高水平ASCL1+早期时间点的RPM细胞（图8A、8B）。人类SCLC-N亚型在7-10天富集，SCLC-Y样本在晚期时间的表现出高比例的非NE特征。这提示个体的人类肿瘤细胞在肿瘤发展的多个阶段，而MYC高表达的肿瘤更像是在肿瘤的最晚期。有趣的是，SCLC-A肿瘤具有较高比例的晚期细胞，这些肿瘤具有更高MYC表达水平以及较高的NOTCH2, HES1, REST,这与NE的降低是一致的（图8A、8C）。 为了证实人类组织中的这些预言，研究者获取了21例人类SCKC活检，由于转移性疾病很少且很难获取SCLC的外科标本。研究者在连续的部位对ASCL1, NEUROD1, YAP1, MYC进行了免疫组化实验。大多数肿瘤上的细胞超过一个亚群，且频繁的出现ASCL1和NEUROD1（图8D、8E），与人类基因表达的数据是一致的（图8A）。大约14%的样本检测到MYC蛋白，但是没有再仅有ASCL1的组别中发现。最终研究者获取一个人类SCLC 样本对卡铂和依托泊苷响应随后继续卡铂-伊立替康来进行scRNA-seq分析。结果发现样本具有不同的ASCL1+和NEUROD1+群体，并且高表达的MYC能够特异性的与NEUROD1-高表达的群体重叠（图8F、8G）。这些数据证实需要对人类组织进行更全面的分析，结合生信预测说明肿瘤细胞具有多样的SCLC亚型。 图8 人类SCLC表现出肿瘤内分子亚型的异质性 结论 本研究表明MYC活化Notch信号通路使SCLC中的神经内分泌细胞沿着保守的轨迹从ASCL1+向NEUROD1+向YAP1+非神经内分泌亚型去分化，提示这些亚型是SCLC进展过程的不同阶段。 更多推荐 1 高分综述 | Trends in Biotechnology: 单细胞分辨率下利用空间转录组揭示器官分子结构（国人佳作）
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