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编译：Mr. Left，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 水稻是在热带和温带地区种植的最重要的农作物之一。但是，它对冷胁迫具有很高的敏感性，而冷胁迫限制了氮的吸收和代谢。为了鉴定涉及耐寒性的基因和途径，尤其是在氮代谢途径中，作者比较了耐寒品种Dongnong 428（DN）和冷敏感品种Songjing 10（SJ）之间的基因和蛋白质表达差异。使用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术和高通量mRNA测序（RNA-seq）技术，作者在DN中鉴定了5549个基因和450个蛋白质，在SJ中鉴定了6145个基因和790个蛋白质，它们在低水温（Tw）处理中差异表达。有354个转录因子（TF）基因（212个下调，142个上调）和366个TF基因（220个下调，146个上调），包括47个基因家族，在对照下的DN（DNCK）和低水温下的DN（D15DN）比较以及对照下的SJ（CKSJ）与低水温下的SJ（D15SJ）比较中差异表达。与水稻寒冷相关生物合成途径相关的基因，尤其是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导，玉米素合成和植物激素信号转导途径，在两个水稻品种中均显著差异表达。与水稻寒冷相关的生物合成途径相关的差异表达蛋白（DEP）在两个水稻品种中均显著差异表达，尤其是谷胱甘肽代谢。氮代谢途径的转录组和蛋白质组分析表明，在低温胁迫下，参与γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酰胺合成的主要基因和蛋白质被下调。可见生殖生长过程中的冷胁迫条件导致与冷胁迫生物合成途径相关的基因和蛋白质在DN和SJ中显著差异表达。本研究证实了已知的冷胁迫相关基因，并确定了新的假定的冷应答基因。本研究还发现冷胁迫下的翻译调控在耐寒性DN中发挥重要作用。低Tw处理影响水稻的氮的吸收和氮代谢，并促进冷敏感SJ中的Glu代谢以及鸟氨酸和脯氨酸的合成。 论文ID 原名：Transcriptome Sequencing and iTRAQ of Different Rice Cultivars Provide Insight into Molecular Mechanisms of Cold-Tolerance Response in Japonica Rice 译名：不同水稻品种的转录组测序和iTRAQ分析揭示了粳稻耐冷反应的分子机制 期刊：Rice IF：3.912 发表时间：2020.06 通讯作者：赵宏伟 通讯作者单位：东北农业大学 DOI号：https:///10.1186/s12284-020-00401-8 实验设计 结果 1 水稻在冷胁迫下的表型和生理响应 图1 低Tw处理的两个水稻品种在生殖生长过程中的表型和生理响应。a，田间冷水处理地块。b，在整个抽穗期，低Tw处理的Dongnong 428（DN）和Songjing 10（SJ）品种的植株。c，对照（CK）和低Tw处理15天后植株中的氮（N）浓度和硝酸盐还原酶（NR），谷氨酸合成酶（GOGAT），谷氨酰胺合成酶（GS），谷氨酸脱氢酶（GDH），天冬氨酸转氨酶（GOT）和丙氨酸转氨酶（GPT）的活性。d，DN和SJ的CK和15 d低Tw处理下的氨基酸含量差异。 2 低温胁迫下mRNA和蛋白质表达的全基因组表达变化 在DN和SJ之间，根的干物质积累和氮代谢相关的生理指标存在显著差异（图1c）。为了了解冷胁迫的调控机制并探索新的调控因子，使用RNA-seq和iTRAQ研究了DN和SJ根中的冷响应转录组和蛋白质组变化。四个样本（CKDN；CKSJ；D15DN；D15SJ）各具有三个生物学重复，用于转录组分析。然后，从这些样品制备12个cDNA文库，并进行双端测序。将基因表达计算为每百万读长的每千碱基的片段数（FPKM）。对于RNA-seq，每个文库的读数范围为31.40至4694万。通过HISAT将高质量片段映射到参考基因组上，每个文库的大多数高质量片段（73.02–88.02％）都完美地映射到了水稻参考基因组上。丢弃无法映射到水稻基因组的片段，仅对映射的片段进行进一步分析。FPKM被用于检测转录本的表达水平，并在生物学重复之间显示出高度相关性（spearman相关系数（SCC）= 0.84-0.98）。与参考基因组相比，在至少一个样品中共检测到43,704个转录本，并发现了12610个新的转录本。 使用iTRAQ对根不蛋白质组的变化进行定量分类。蛋白质组分析中每个样品有三个生物学重复。搜索算法Mascot用于鉴定蛋白质。从两个水稻品种的根产生了1,184,867个光谱。共有265,517个光谱与已知蛋白质序列匹配，并且212,755个光谱唯一匹配。还存在11,666个映射肽，32,750个映射独特肽和7281个映射蛋白，假发现率（FDR）为1％。基于变异系数（CV）的重复性分析显示，当CV值小于50％时，在鉴定出的全部蛋白质中可以发现超过95％的蛋白质。 根据iTRAQ结果，在转录组数据中检测到88.8％的蛋白质，占检测到的转录本总数的14.8％（图2a）。为了探索蛋白质及其相应基因之间的关系，计算了每组的Spearman相关性。比较结果表明，从两种技术获得的数据之间的一致性较低（Spearman相关系数在-0.07和0.10之间）（图S1）。 为了探究蛋白质及其相应基因之间的关系，在每种处理中将所有表达的蛋白质与其相应基因进行匹配，并观察到较弱相关性，r值介于0.14至0.31之间。这些结果表明基因表达不能完全说明蛋白质组分的丰度，并且在蛋白质生产过程中可能存在强大的翻译后调控。这些结果表明基因表达不能完全解释蛋白质组分的丰度，并且在蛋白质产生过程中可能存在强大的翻译后调控。 图2 两个水稻品种根部蛋白质和转录本丰度的比较。a，检测到的转录本与稻胚乳蛋白质之间的一致性。b，根中差异表达蛋白质的数量（P值<0.05的变化为1.2倍）。c，根中差异表达基因的数目（FDR ≤ 0.01的log2的绝对值（FC ≥ 1，）。 3 水稻品种的冷响应转录组差异 使用R软件包DEseq2检查差异基因表达，以量化和分析所有对照和处理组合。在冷暴露的15天中，D15DN和CKDN之间的根中共有5549个基因差异表达，其中3539个基因被下调而2010个被上调。在D15SJ和CKSJ之间的根中有6145个基因被差异调节，其中3690个基因被下调，而2455个基因被上调（图2b）。经过冷处理后，两个水稻品种中差异表达基因的数量相似，这表明两个品种对冷胁迫的响应之间存在一些相似性。 为了确定在冷胁迫期间受影响的植物系统，针对GO数据库搜索DEG以进行富集分析。GO数据库的富集分析分为三种本体：分子功能（MF），细胞组分（CC）和生物过程（BP）；在CKDN与D15DN和CKSJ与D15SJ的比较中，分别有19个和16个GO术语显著不同（P ≤ 0.05）。 CKDN对D15DN和CKSJ对D15SJ的DEG富集术语集中于膜的固有成分和磷酸转移酶活性（以醇基团为受体）。CKDN对D15DN的特定富集术语包括细胞周边和质膜，钙调素结合（以及离子结合），二萜类代谢过程，细胞离子稳态和金属离子转运。对于CKSJ与D15SJ的比较，已鉴定了氧化还原酶活性（通过结合分子氧并结合两个氧原子作用于单个供体），海藻糖代谢过程，离子转运，细胞蛋白修饰过程和蛋白修饰（图3b）。 进行了KEGG途径富集分析，以鉴定涉及冷胁迫的生物学途径。以前的研究表明，拟南芥中发生了许多代谢变化，以增强其对冷冻条件的耐受性，影响了卡尔文循环，氮代谢，淀粉合成和糖合成等过程。通过应用Q值≤ 0.05的截断标准，结果表明CKDN vs. D15DN和CKSJ vs. D15SJ组分别有6条途径和1条途径被显著富集（图3a）。 CKDN与D15DN之间富集的途径包括MAPK信号转导途径，二萜类生物合成，植物-病原体相互作用，植物激素信号转导，柠檬烯和蒎烯降解以及玉米素的生物合成。CKSJ与D15SJ之间富集的途径是植物与病原体的相互作用。 大量研究表明，MAPK信号通路在暴露于寒冷条件下的植物中具有有益作用。CKDN vs.D15DN中的MAPK信号通路中涉及184个DEG，而CKSJ vs.D15SJ中只有164个DEG（图3a）。在CKDN与D15DN中的MAPK信号通路中，有20个基因被特异性上调，而55个基因被特异性下调，包括2个乙烯受体（Cht9和ERS2），3个LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Os01g0191200、107,275,384和107,278,972）和2个WRKY转录因子（Os08g0500300和107,281,845）。 图3 两个水稻品种的冷响应转录组和蛋白质组变化的富集分析。a，气泡图中显示的差异表达基因和蛋白质的KEGG富集分析。b，热图显示差异表达基因和蛋白质的GO富集分析。 4 对比水稻品种的冷响应蛋白质组学变化 对于增加的积累，将截断阈值更改为1.2倍，对于减少的积累，将阈值更改为0.83倍，同时使用多个≥2的独特肽段。根据这些标准，在D15DN和CKDN之间的根中总共有450种蛋白质差异表达，其中215种被下调，而235种被上调。在D15SJ和CKSJ之间，根中有790种蛋白质被差异调节，其中454个被下调，而336个被上调（图2c）。 基因本体论（GO）富集分析用于从差异表达蛋白的本体论中鉴定出过表达的术语。在表S5中可以找到p值≤0.05的所有富集术语的完整列表。 CKDN与D15DN和CKSJ与D15SJ比较组的DEP的GO项富集分析包括氧化还原酶活性，亚铁原卟啉结合，催化活性，胞质膜结合囊泡，氧化还原过程，二萜植保素代谢过程，对冷的响应以及对氧化胁迫的响应。CKDN与D15DN组富集的特定术语是铁离子结合，金属离子结合，对映柯巴基焦磷酸合酶活性，谷氨酸合酶（NADH）活性，细胞表面和细胞质糖原生物合成过程。对于CKSJ对D15SJ组，富集术语还包括与镉离子，外部封装结构和质膜，水解酶活性，糖基键，氧化还原酶活性和供体的CH-OH基团相关的术语（图3b）。 CKDN与D15DN和CKSJ与D15SJ组中富集的KEGG途径是二萜类生物合成，苯丙烷类生物合成，类黄酮生物合成，角质，木栓质和蜡类生物合成，氨基糖和核苷酸糖代谢，氨基酸的生物合成，抗坏血酸代谢，碳代谢以及黄酮和黄酮醇的生物合成。CKDN与D15DN的特异性富集途径是类胡萝卜素的生物合成， CKSJ与D15SJ组富集途径是谷胱甘肽代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，光合生物中的碳固定以及脂肪酸生物合成（图3b）。 以前已经有研究涉及二萜类生物合成的基因和响应冷胁迫的苯丙烷类生物合成途径。转录组（39个基因）和蛋白质组（9个基因）数据富集了二萜类生物合成。Os04g0178400（CYP99A3），Os12g0491800（KSL10），Os02g0570700（CYP71Z7），Os01g0561600和Os04g0178300（CPS4）在转录组和蛋白质组数据中均上调。 5 两个水稻品种冷响应机制的差异的转录组和蛋白质组学的结合分析 维恩分析显示，在转录组数据中，CKDN/D15DN组上调了1015个DEG，下调了904个（图4a，b）。维恩分析表明，在蛋白质组数据中，CKDN/D15DN组中只有38个DEP被上调，而50个被下调（图5a，b）。CKDN/D15DN组的蛋白质组和转录组数据中只有5个上调的DEP和9个下调的DEP，每组的Spearman相关系数都较低，介于-0.07和0.10之间（图S1），表明较强的翻译后调控作用以及转录组和蛋白质组分析的互补性。上调的基因包含天冬氨酰蛋白酶家族蛋白（Os06g0304600）；郁金香苷A转化酶b6（Os09g0455900）；可能的聚半乳糖醛酶（Os06g0106800）；和烯醇酶1（Os06g0136600）；地衣多糖酶2（Os05g0375400）。下调的基因包括FAR1；PRXIIE-2；CYP76M7；CXE15；CPS2；AIG2LD；ALDH2C4；未表征的异构酶BH0283（Os01g0266500）；和碱性分泌蛋白酶（Os10g0491000）。CYP76M7参与氧化还原酶活性，萜类生物合成过程，脂质代谢过程，植保素代谢过程和氧化还原过程。CPS2参与镁离子结合，裂解酶活性，萜类生物合成过程，脂质代谢过程和植保素代谢过程。烯醇酶1参与镁离子结合，裂解酶活性，氧化还原酶活性和氧化还原过程；CYP76M7，CPS2和烯醇酶1可能在抵抗冷胁迫中起重要作用。 结合DEG和DEP，在CKDN/D15DN组中发现了1048个上调基因和945个下调基因（图4a，b）。上调和下调的基因的GO富集分析确定了热响应，电子传递链，类黄酮葡萄糖醛酸化和无机阴离子迁移相关基因。确定了7个与“热响应”有关的基因：Os06g0104100，Os03g0268400，Os01g0688900，Os07g0517100，Os05g0334000，Os01g0136100和Os05g0519700，它们也可能参与了抵御冷胁迫。鉴定出参与“无机阴离子迁移”的8个基因：Os01g0645900，Os06g0324800，Os01g0704100，Os01g0547600，Os10g0420400，Os01g0304100，Os03g0196000和Os07g0524000。还富集了细胞组分，叶绿体类囊体膜，叶绿体，ATP结合组件（ABC）转运蛋白复合物，质体外膜，胞外区和微管骨架等术语。Os01g0836600和Os01g0393400与术语ATP结合组件（ABC）转运蛋白复合物相关。从分子功能上讲，以多糖结合，rRNA结合，蛋白酪氨酸激酶活性，无机阴离子跨膜转运蛋白活性，槲皮素3-O-葡萄糖基转移酶，O-乙酰基转移酶活性，萜烯合酶活性，植物型液泡膜，GTP结合和蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性为代表。7个基因参与“rRNA结合”：Os03g0356300，Os02g0489400，Os12g0133050，Os03g0122200，Os08g0130500，Os07g0628400和Os05g0270000（图4c）。 图4 两个品种的转录组比较分析揭示了耐寒性机制。a，在对照下的Dongnong 428（DN）（CKDN）与在低Tw下的DN（D15DN）和在CKSJ与D15SJ下的Songjing 10（SJ）中下调差异表达基因维恩图。b，CKDN与D15DN和CKSJ与D15SJ中上调差异表达基因的维恩图。c，特异性CKSJ与D15SJ差异表达基因的GO富集分析。 图5 水稻品种的蛋白质组比较分析揭示了耐寒性机制。a，在对照下的Dongnong 428（DN）（CKDN）与在低Tw下的DN（D15DN）和在CKSJ与D15SJ下Songjing 10（SJ）中下调的差异表达蛋白维恩图。b，CKDN与D15DN和CKSJ与D15SJ中上调差异表达蛋白的维恩图。c，使用Cytoscape对特定CKSJ与D15SJ差异表达基因进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。 6 响应冷处理的转录因子（TFs）的鉴定 转录因子（TFs）在植物对低温的响应中起着重要作用，因为它们调节下游基因以应对冷胁迫。TF基因的鉴定可以提供对冷胁迫响应系统的分子机制的了解，作者发现至少在1个品种中表达了1869个TF。共有354个TF基因（212个下调，142个上调），366个TF基因（220个下调，146个上调），包括47个基因家族，分别在CKDN/D15DN和CKSJ/D15SJ中差异表达（图6）。 在CKDN 对D15DN组中，有101个TF（42个下调，59个上调）差异表达。从PlantRegMap数据库中，我们发现14个差异表达的TF具有2250个靶向基因和总共2831个靶向关系对。在这14个TF中，有13个被上调，而一个被下调。在2250个基因中，CKDN对D15DN组中有349个差异表达，其中164个上调而185个下调。14个差异表达的转录因子和349个差异基因构成355个靶向关系对。 Dof转录因子家族是高等植物中最重要的转录调节因子家族之一，并参与植物的生长，发育以及对非生物胁迫的响应。属于C2C2-Dof家族的Os03g0821200，Os07g0685000，Os10g0406300，Os05g0112200和Os12g0569900基因在CKDN对D15DN组中被上调。Os03g0821200和Os07g0685000分别调控39个（19个上调，20个下调）和4个（3个上调，1个下调）靶基因。生长素转运蛋白REH1被上调，生长素应答蛋白IAA26被下调，表明Dof家族可能通过调节生长素运输和响应而适应冷胁迫。 ERF基因参与发育调节和环境响应。在CKDN与D15DN组中，属于ERF家族的Os06g0194000和Os03g0860100的基因被上调，Os08g0565200基因被下调。Os05g0403400和Os02g0749900基因与线粒体和氮化合物代谢过程的GO术语分组在一起。3个ERF家族基因控制了328个基因的表达（158个上调和170个下调）。上调的基因包括GAUT14（半乳糖醛酸转移酶14），GAUT7（半乳糖醛酸转移酶7），泛素激活酶E1和RING-H2锌指蛋白ATL5F。下调的基因包括组蛋白H2A，细胞色素P450 CYP734A7，δ12油酸去饱和酶FAD2和生物节律因子ZGT。 MYB家族很大，并且参与控制各种过程，例如对生物和非生物胁迫的响应，发育，分化，新陈代谢和防御。属于MYB家族的Os08g0178900，Os05g0140100，Os11g0180900，Os08g0151300，Os07g0634900，Os01g0192300，Os01g0274800，Os02g0685200，Os09g0538400，Os01g0128000，Os11g0684000，Os06g0105800和Os11g0207600基因在CKDN对D15DN组被上调。6个MYB家族成员调控46个靶基因（21个上调和25个下调）。上调的基因包括硫胺噻唑合酶THI1，类黄酮3'-单加氧酶CYP75B4，下调的基因包括糖转运蛋白MST5，肌动蛋白解聚因子3 ADF-3和双功能核酸酶1（OsBBD1）。 WRKY转录因子是植物中最大的转录调节子家族之一。已经发现WRKY基因在生物和非生物胁迫响应中起着重要作用，并且还调节生长和发育。使用PlantRegMap数据库没有找到有靶向WRKY的基因，但在这项研究中发现了推定的新基因。属于WRKY家族的Os07g0111400，Os12g0597700，Os01g0586800，Os06g0146250，Os12g0116700，Os08g0235800、107,277,882，Os11g0117500，Os11g0685700，Os06g0158100和BGI_novel_G000104基因在CKDN对D15DN组中被上调。Os07g0111400，Os12g0597700，Os01g0586800，Os06g0146250，Os08g0235800，Os11g0685700，Os06g0158100和BGI_novel_G000104基因参与MAPK信号通路。WRKY TFs参与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径，该途径与胁迫诱导的防御反应有关。 图6 对冷响应有反应的转录因子（TFs）的鉴定。 7 响应冷胁迫的氮代谢的代谢，转录组和蛋白质组分析 在低Tw处理中，DN和SJ的根部N含量比对照低分别低15.4%和25.4％。氨基酸含量分析表明，D15DN中的Glu含量显著低于对照，而Pro含量则稍高于对照。与对照相比，在D15SJ中，谷氨酸含量较高而Pro含量稍低。与D15SJ相比，D15DN中的谷氨酸含量降低了64.7％，而Pro含量则提高了42.9％。 氮代谢途径的转录组分析，鉴定了D15SJ/CKSJ组中下调的9个基因（图7a，b），包括3个与GABA合成有关的谷氨酸脱羧酶基因，2个与谷氨酰胺合成有关的谷氨酰胺合成酶基因，1个从谷氨酰胺合成谷氨酸有关的谷氨酸合成酶基因，2个与L-谷氨酰5-磷酸有关的δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因以及1个与N-乙酰基-L-谷氨酸的合成有关的氨基酸N-乙酰基转移酶基因。D15DN/CKDN组中有6个基因下调，包括3个与GABA合成有关的谷氨酸脱羧酶基因，2个与谷氨酰胺合成有关的谷氨酰胺合成酶基因和和一个与L-谷氨酰5-磷酸合成有关的δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因。与D15SJ相比，D15DN中没有基因显示出显著的上调或下调。 氮代谢途径的蛋白质组学分析鉴定了D15SJ/CKSJ组中上调或下调的5种蛋白质（图7b，c），包括2个与与GABA合成有关的谷氨酸脱羧酶蛋白和1个与从精氨酸合成L-鸟氨酸有关的精氨酸酶基因被下调。在D15SJ对CKSJ组中，1个与谷氨酸合成有关的谷氨酸合酶基因和1个与L-鸟氨酸合成有关的鸟氨酸氨甲酰转移酶基因被上调。在D15DN/CKDN组中，与谷氨酸合成有关的两个谷氨酸合酶基因被上调。与D15SJ相比，与鸟氨酸合成有关的鸟氨酸氨甲酰转移酶基因在D15DN中显示出显著的上调。 图7 转录组和蛋白质组分析的氨基酸代谢途径中的表达差异。a，KEGG途径数据库中的氨基酸代谢途径。b，转录组氨基酸代谢途径中差异表达的基因。c，蛋白质组氨基酸代谢途径中差异表达的蛋白质。 讨论 1 转录组分析不能完全代表蛋白质组分析 对稳定状态下的mRNA和蛋白质丰度的比较分析以及在不同环境条件下发生的表达变化表明，转录仅是故事的一半。mRNA和蛋白质变化的不一致揭示了负责蛋白质水平调节变化的基因。在本研究中，分别在转录组和蛋白质组数据中检测到了43704个转录本和7281个蛋白质。虽然转录组测序可以检测更多的基因表达，但超过80％的差异表达蛋白在转录组中并未差异表达。我们还在每种处理中将表达的蛋白质与其相应的基因进行匹配，并观察到弱相关性，表明基因表达不能完全代表蛋白质组分的丰度，并且在蛋白质组分产生过程中可能存在强大的翻译后调控。 2 转录因子在水稻对冷胁迫的响应中的作用 植物对冷胁迫的耐受性涉及复杂的TF和其他调控基因的调控网络，这些调控基因控制酶，调控蛋白和代谢产物。在本研究中，来自5个TF家族的基因，包括C2C2-Dof，C2C2-GATA，WRKY，GRAS和MtERF，被鉴定为COR基因。在以前的研究中，过表达某些基因的植物（如OsCOIN，OsMYB2，OsMYB4，OsMYB3R-2和OsZFP245）显示Pro含量显著增加，并增强了其对低温的耐受性。在本研究中，与D15SJ相比，D15DN中的Pro含量增加了42.9％。属于MYB家族的Os08g0178900，OsMYB2P-1，Os11g0180900，OsMYB103，Os07g0634900，Os01g0192300，CSA，Os02g0685200，Os09g0538400，Os01g0128000，OsJAMyb，Os06g0105800和Os11g0207600基因仅在CKDN与D15DN组中上调。已经表明，OsMYB2P-1的表达是由寒冷，盐分和渗透胁迫条件诱导的，这表明OsMYB2P-1与低温胁迫下水稻中的Pro积累相关。 Dof转录因子家族是高等植物中最重要的转录调节因子家族之一，并且参与植物的生长，发育以及对非生物胁迫的响应。属于C2C2-Dof家族的OsDof16，OsDof24，OsDof27，OsDof19和OsDof29基因仅在CKDN对D15DN组中上调。 WRKY TFs参与MAPK信号转导途径，该途径参与胁迫诱导的防御反应。在本研究中，属于WRKY家族的OsWRKY29，OsWRKY29，OsWRKY83，OsWRKY27，OsWRKY73，OsWRKY64，OsWRKY25，WRKY117、107,277,882，OsWRKY40，OsWRKY93和Novelgene_G000104基因仅在CKDN与D15DN组中被上调，且OsWRKY29，OsWRKY83，OsWRKY27，OsWRKY73，OsWRKY25，OsWRKY61，OsWRKY93和Novelgene_G000104参与了MAPK信号通路。此外，以前已经发现WRKY TF在非生物胁迫下参与Glu和Pro的代谢。通过在盐胁迫下直接调节SOS2和P5CS1同源物，金柑的转录因子FcWRKY40在Pro生物合成中发挥积极作用。OsWRKY40可以通过调节Pro积累和MAPK信号转导途径中的一组冷胁迫应答基因来赋予转基因植物抗寒性。 CBF-COR调节信号通路高度复杂，需要进一步深入研究。以前的研究中对三重突变体的RNA-seq分析显示，COR基因的10–20％的表达是CBF依赖性的。在本研究中，CBF1在D15DN中显示出比D15SJ中更大的上调。ICE1通过在冷胁迫条件下直接与其启动子结合来激活CBF基因的表达。ICE1的突变会削弱冷诱导的CBF表达并降低抗寒性。在本实验中，ICE1（LOC_Os01g0928000）在D15DN中的上调程度高于D15SJ。 已显示许多WRKY蛋白对多种非生物胁迫有反应，例如冷胁迫。几种不依赖CBF的调节因子，即冷诱导的转录因子，以与CBF相似的方式发挥作用，并且可以在冷胁迫下诱导COR基因的表达，包括WRKY33和MYB73。在本研究中，发现CKDN与D15DN组中比CKSJ与D15SJ组中有更多的WRKY和MYB基因上调。 3 氮代谢对冷胁迫的响应 尽管Glu在植物抗渗透性中的实际作用仍然存在争议，但有证据支持其对酶和膜的完整性，渗透调节和清除自由基具有积极作用。尽管如此，一些作者仍认为，胁迫下的Glu积累是应激的产物，而不是对胁迫的适应性响应。一项以前的研究发现，在生殖生长过程中，低Tw处理严重影响了水稻的氮吸收，谷氨酸含量和谷氨酸脱氢酶（GDH）活性分别是影响籽粒产量和小穗不孕的重要形状。在本研究中，发现在低Tw处理中，与对照组相比，D15DN中的Glu含量显著降低，而Pro含量则略有增加。在D15SJ中，Glu和Pro含量的趋势与D15DN中观察到的趋势相反。与D15SJ相比，D15DN中的Glu含量降低低64.7％，而Pro则增加42.9％。 这些结果可以归因于几个因素。如氮代谢的关键酶活性和氨基酸含量（图1c，d）所示，D15SJ的GOGAT活性和GS活性的增加（69.0％和59.3％）大于D15DN（43.8％和29.6％）；与对照相比，D15SJ中GDH活性的增加（58.0％）低于D15DN（85.3％）。GDH活性已被证明可以抵抗各种胁迫条件，并且GDH催化Glu的可逆氧化脱氨反应，从而提供2-氧戊二酸和铵。其次，Glu在植物的氨基酸代谢中起着核心作用，它可能在非生物胁迫下协调关键的代谢功能。例如，GABA和Pro生物合成各自在植物防御机制中发挥关键作用。Pro的生物合成中使用了D15DN中大量的Glu，这导致D15DN中的Glu含量较低，而Pro的含量较高。此外，与D15SJ相比，参与L-鸟氨酸合成的鸟氨酸氨甲酰转移酶基因在D15DN中显示出显著的上调，表明低Tw处理可能促进了D15DN中的Glu代谢，鸟氨酸和Pro的合成。 结论 在所研究的两个水稻品种（DN和SJ）中，生殖生长期间的冷胁迫导致与冷胁迫的生物合成途径相关的基因和蛋白质均显著差异表达。DN在氮代谢，MAPK信号通路和转录因子的调节方面更有效。本研究证实了已知的冷胁迫相关基因，并鉴定了新的假定冷响应基因。研究表明，冷胁迫下的翻译调控在耐寒性DN中发挥重要作用。低Tw处理影响水稻对氮的吸收和氮代谢，并促进冷敏感SJ中的Glu代谢，鸟氨酸和Pro的合成。 评论 作为最重要的农作物之一，水稻对冷害非常敏感，因此研究其对冷胁迫的响应机制极其重要。本研究通过筛选，选择耐寒品种和冷敏感品种进行低水温处理，发现两种水稻品种在生殖生长期间冷胁迫导致与冷胁迫的生物合成途径相关的基因和蛋白质均显著差异表达，且发现mRNA和蛋白质变化的不一致，表明了基因表达不能完全代表蛋白质组分的丰度，并且在蛋白质组分产生过程中可能存在强大的翻译后调控。此外一系列转录因子在两种水稻冷胁迫过程中发挥重要作用。冷胁迫影响了两种水稻的氮代谢，该研究发现冷胁迫有助与水稻对氮的吸收和代谢，并且本研究发现胁迫过程中Pro合成时使用大量的Glu，导致Glu的减少，进而帮助水稻抵御冷胁迫。本研究为进一步研究水稻对冷胁迫的响应机制提供一定的帮助。 |
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