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编译：夕夕，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读未折叠蛋白反应（UPR）和热激反应（HSR）是两个进化上保守的保护植物面授热胁迫的系统。UPR和HSR发生在不同的细胞间室，并且这两种反应均是由错误折叠蛋白质引起的，这些蛋白质会在不利的环境条件下积累。虽然UPR和HSR是相互独立的，但作者发现在玉米中UPR和HSR之间存在联系，其中涉及BASIC LEUCINE ZIPPER 60(bZIP60)转录因子的产生，是UPR对热胁迫的关键反应。令人惊讶的是，敲除bZIP60的突变体（bzip60-2）在高温下钝化了HSR，并阻止了HSP基因在高温下上调表达。热休克转录因子13（HSFTF13）的表达在bzip60-2中受损，且HSFTF13启动子是玉米原生质体中bZIP60的靶标。此外，bzip60-2抑制了叶绿素分解代谢，且这些基因也是bZIP60的靶标。因此，UPR是一种与内质网相关反应，有助于玉米热应激反应。原名：The Transcription Factor bZIP60 Links the Unfolded Protein Response (UPR) to the Heat Stress Response (HSR) in Maize 译名：转录因子bZIP60将玉米的未折叠蛋白反应（UPR）与热应激反应（HSR）联系起来期刊：Plant Cell IF:9.618 发表时间：2020.8 通讯作者：Stephen H. Howell 通讯作者单位: 美国爱荷华州大学 DOI号：10.1105/tpc.20.00260 
为评估热胁迫对玉米的影响，作者使用Enviratron设施来模拟田间条件。Enviratron是由八个生长室组成，植物可以经受不同的环境条件。作者将玉米培养在模拟日照和温度正常的昼夜节律下，并增加最高每日温度（MDT）。玉米在四种不同的温度条件下生长，模拟早晨温度在6小时内分别上升至31°C，33°C，35°C和37°C，模拟夜间温度在8小时内下降至10°以下（图1A）。在16小时/8小时的光周期循环中，光强度逐渐升高至1200μmol/ m2 / sec（距离光源60 cm）以模拟黎明，并在2小时内降低以模拟黄昏。在生长的不同阶段，营养中期和生殖阶段评估了植物的生长性能。在33°C MDT下生长的植物产生最大的枝条生物量（干重），而在37°C MDT下生长的植物上的枝条生长有所减少。为了评估不同的MDT对基因表达的影响，从V4和V5植物的第一片完全展开的叶片中提取RNA。在早晨，每2小时对V4阶段的植物进行三次重复采样（图1A），并提取RNA并进行RT-PCR。植物通过上调热应激反应（HSR）基因来响应温度的缓慢升高，例如热休克蛋白26（HSP26，Zm00001d028408），该基因在11：30表达量首先达到峰值（图1B）。bZIP60随着温度的上升而表达量升高。bZIP60的转录本其剪接形式会影响IRE1的激活，IRE1是与内质网相关的RNA剪接因子。在温度达到35°C或37°C约2小时后，bZIP60逐渐积累。一些典型的UPR基因，例如PDI1和CRT2也会上调表达（图1B）。内质网应激和热应激会诱导植物自噬。因此，作者想要探讨自噬是否会由较高的MDT诱导，如果是，自噬是否会遵循与其他UPR指标相同的昼夜温度模式。一种用来代替自噬活性的方法是自噬相关蛋白8 (ATG8)的脂化。ATG8的脂化和非脂化形式可以在尿素凝胶上分离，其中脂化形式(ATG8-磷脂酰乙醇胺(ATG8- pe))比非脂化形式迁移更快(图1C)。作者已经证实，当萃取物被分离为可溶性和膜组分时，这种形式定位于膜，而上面的条带表示未脂化的ATG8是可溶性的，迁移速度更快的形式代表ATG8- PR。此外，当提取物用磷脂酶D处理时，膜组分中ATG8- pe会丢失，在此基础上只能检测到未脂肪化的ATG8。ATG8的脂化形式，ATG8- PE，在下午3点30分达到高水平，特别是在35℃和37℃较高时（图1C）。作者想知道在田间条件下，周围观察到的bZIP60剪接和自噬诱导的日变化模式是否在玉米中复制。在爱荷华州的夏日，气温预计将达到38摄氏度，天空全天无云，作者每隔2小时对V9发育阶段的不同植物的第一片完全展开的叶子进行取样。在高于地面的高度记录了空气温度，采集了三份叶片样本（图1D）。从叶片样本中提取RNA和蛋白，并对bZIP60剪接和ATG8脂化进行评估。在14：30左右，bZIP60开始表达。随着下午晚些时候和傍晚早些时候气温的下降，bzip60的表达开始下降。在6:30的样品中，ATG8脂化表明，在日出时(黑夜之后)自噬水平较高。ATG8-PE水平在16:30左右开始上升，同时UPR标记bzip60达到峰值。ATG8-PE水平持续上升，直到最后一个样本在20:30。因此可以证实在野外的UPR和自噬的日常模式与在环境中获得的模式相似。
由于作者在MDTs中观察到bZIP60 mRNA的剪接反应较强，因此作者研究了bZIP60是否在玉米中具有耐热性。玉米基因组包含一个单一的bZIP60同源基因(Zm00001d046718)，为了确定其在玉米中的功能，作者利用bZIP60中的Mu转座子插入进行了分析。有三种不同的Mu插入系，作者称之为bzip60-1、-2和-3，插入基因的5 ' -UTR和3 ' -UTR（图2A）。在5 ' -UTR中插入的bZIP60 -1和bZIP60 -2，降低了bZIP60的表达(图2B)。这两种细胞系对42℃的热胁迫敏感，但在3 ' -UTR中插入的bzip60-3则不敏感（图2C）。作者对两株bzip60-2中的一株进行了进一步的检测，结果表明bzip60-2的热敏表型与突变基因在BC1 F1分离群体中共显异型（图2D）。作者比较了bzip60-2和W22亲本在不同MDTs下的性能，并对bzip60-2进行了两个回交代（BC2F2）的测试。在设定相同温度条件的环境中，每个基因型各有12株植株分裂在两个室中，即相同温度条件的两个室中各有6株bzip60-2和6株W22。收获植物，干燥后称重以确定V6生物量。在31℃和33℃MDT条件下生长的bzip60-2植株的身高与W22植株相似（图2E），然而，bzip60-2的叶片和茎部更纤细，生物量（干重）始终低于W22，与W22在37℃时相比，37℃时bzip60-2的生长明显降低（图2F）。这表明，bzip60-2降低了营养生长，这一缺陷使突变植物对温度敏感。
通过RNAseq分析，作者深入分析了温度达到MDT时，温度对W22和bzip60-2 V4株和V5株基因表达的影响。PCA分析表明，各个样本之间存在一致性，但不同条件和基因型之间存在基因表达差异。在V4和V5期MDT增加的情况下，共有数千个差异表达基因（DEGs）。W22在V4阶段，随着MDT增加，DEG数量增加（图3A）。然而，W22在V5阶段，在33°C和35°C时，上调的差异表达基因远多于下调的差异表达基因（图3C）。在bzip60-2中，V4阶段DEG较多，而V5阶段DEG较少（图3B）。在V4期33°C和31°C及V5期37°C和31°C时，突变体中下调的差异表达基因数量多于上调的差异表达基因数量。
根据RNAseq数据分析表明，HSR基因对温度的反应最为敏感。HSP基因受HSFs控制，其中9个HSFs在高温下上调表达（图4A）。其中一个HSF（HSFTF13、HSFA6B、Zm00001d027757）在V4和V5阶段随着MDT的升高表达量升高。HSP基因在35°C、37°C的V5阶段上调表达。然而在V5期，37℃时HSP基因的上调略低于35℃时，表明较高温度下生长时间的延长可能影响了HSP基因表达的上调。因为bZIP60转录本的剪接是由热引起的，所有作者想知道处理CRT2和PDI1外，是否还有其他UPR基因也受到了控制。在V5不同温度下差异表达的基因中，有少数是典型的UPR基因（图4C）。
作者使用RNAseq分析鉴定bzip60-2和w22在不同MDT的差异表达基因。在V4阶段，四个MDT中，bzip60-2的上调DEG比W22中多。这一趋势在V5阶段不明显。对上调基因进行GO分析，结果表明没有特异性富集具有相同功能的基因。然而，对于31°C常温条件下，与W22相比，bzip60-2中下调的DEG富集在发育和代谢功能。这可能有助于解释为什么即使在常温条件下(31℃MDT)， bzip60-2植物的生物量也少于W22。在bzip60-2和W22的比较中，根据表达模式可以将DEGs分为两类。组I基因在两系间表达不同，但不响应MDTs的增加;组II基因在两系间表达不同，也响应MDTs的增加。bzip60-2和W22在正常温度(31℃)条件下的比较显示，I组中高度DEGs参与了胚胎后发育、囊泡介导的转运和蛋白降解以及转录调控过程。对组ⅡDEGs使用k-means聚类算法进一步划分为6个聚类。cluster1的DEGs在bzip60-2中表达低于W22，但在MDTs升高时在两种基因型中均表达上调。相反，cluster 3的DEGs在bzip60-2中表达较高，但被MDTs升高抑制。作者意外地发现，许多HSP基因是属于cluster 1的II组DEGs，它们在bzip60-2中表达低于W22，但在升高的温度下被诱导表达。HSP基因在MDT升高时在W22中表达上调，而在bzip60-2中表达较少，尤其是在35℃时V5 (27 DAG)植株中（图5）。为了寻找这种效应的解释，我们研究了上述A型热休克因子HSFTF13 (Zm00001d027757, HSFTF13, HSFA6B)，该因子在MDT升高时上调。我们发现HSFTF13在亲本W22中表达升高，而在突变体bzip60-2中没有（图6A）。W22中的HSFTF13在较高温度下，特别是在35℃时上调，但在任何温度下bzip60-2中都检测不到该基因的表达。该基因是MDT升高时bzip60-2中唯一未上调的HSF基因。
图5 bzip60-2对不同MDT下HSP基因表达的影响由于HSFTF13在bZIP60 -2中没有上调，所以作者想知道它是否是bZIP60的靶标。作者检测了HSFTF13的启动子，在翻译开始的1.5 kb内发现了两组UPR响应元件。由UPRE-IIIa&b (TCATCG/CGATGA)和UPRE-I (TGACTG/CAGTCA)组成。在拟南芥中已经证实UPRE-III是AtbZIP60的结合位点。为了确定bZIP60是否激活HSFTF13的表达，作者在35S启动子驱动的玉米原生质体bZIP60 (bZIP60剪接形式)中共同表达了含有与荧光素酶基因连接的HSFTF13启动子的构建物。作者发现，随着bzip60的表达，荧光素酶的表达量增加了近7倍（图7B）。为了确定UPR启动子元件是否直接激活，作者将UPRE-IIIa、UPRE-IIIb和UPRE-I突变为突变组M1和UPRE-IIIc，将bZIP17/28结合位点突变为突变组M2（图6C）。M1组中两个UPRE-III和UPRE-1元件的突变降低了原生质体实验中的启动子活性，而M2组中UPRE-III和bZIP17/28结合位点的突变进一步降低了启动子活性（图6C）。两组(M1和M2)的突变将启动子活性降低。作者得到结论，bzip60确实激活了HSFTF13的表达，而这种激活依赖于HSFTF13基因启动子中的UPR顺式元件。因此，作者将bzip60-2在热响应中未能完全上调HSP基因归因于HSFTF13表达不足。
图6 bzip60-2对不同MDTs下不同基因表达的影响在MDT升高时，bzip60-2较明显的热应激表现之一是随着时间的增加，bzip60-2的衰老和绿度的丧失加快。作者通过高光谱反射率自动监测叶绿素指数。在37℃MDT条件下，我们观察到bzip60-2植株叶绿素指数普遍下降，尽管不同bzip60-2植株的下降速率不同（图7A）。部分bzip60-2植株的叶绿素含量在19 DAG左右开始迅速下降。这些植株在24 DAG后死亡，而其他一些bzip60-2植株没有死亡，但它们最早的叶子倾向于漂白和死亡。在评估V4阶段参与叶绿素合成和降解的基因表达水平时，作者观察到随着温度升高，参与叶绿素合成的基因，如编码原叶绿素氧化还原酶C、PCR1和pheophorbide a氧合酶CH1的基因表达水平普遍下降（图7B）。与叶绿素合成基因下调相反，叶绿素降解基因如叶绿素酶1 (CLH1)和不黄变1 (NYE1)，它们分别将叶绿素a转化为叶绿素a和叶绿素a转化为脱叶绿素a，在不同的MDTs下，bzip60-2上调了叶绿素降解基因（图7B）。
图7 MDT和bzip60-2对玉米叶片叶绿素指数的影响然而，为了确定bZIP60是否激活VPS46的表达，作者将启动子与前面所述的荧光素酶报告物相连接，并在含有bZIP60表达结构的玉米原生质体中共同表达（图6B）。含有3个UPR启动子元件的VPS46启动子被bZIP60的表达激活近4倍，表明VPS46确实也是bZIP60的一个可能靶点。综上所述，随着MDT的增加，bzip60- 2中绿色度的损失与一些叶绿素合成基因表达的下降和一个可能参与叶绿体组分自噬周转的基因表达的增加相对应。为了评估UPR在生长后期营养和生殖阶段的影响，W22和bzip60-2植株与V4-V5植株所处的条件相同，只是允许它们生长到生殖阶段。作者测量了成熟植株茎秆上的节间长度（图8A），发现在生长中期，从大约5-9个节间开始，W22和bzip60-2的节间都随着MDT的增加而逐渐缩短（图8B）。然而，在最佳MDT(33-35℃)条件下，植株后期节间10-14的伸长更大，而W22与bzip60-2的节间长度差异在较高的MDTs条件下最为明显（图8C）。因此，对于W22和bzip60-2来说，在最佳MDTs时，晚期节间的伸长似乎比在较高或较低MDTs时更明显。在后期，作者还比较了V13处的株高和茎生物量（图8D）。在这些阶段，很明显bzip60-2突变不利于营养生长——突变体植株较短，且鲜重较低，特别是在较高的MDT下。作者还比较了W22和bzip60-2的花期，并以穗的出现作为这一性状的衡量指标。结果表明，bzip60-2比亲本W22早花，特别是在较高的温度下。这可能是由于bZIP60活性不足所造成的高温下的额外胁迫阻碍了营养生长，导致开花提前。
图8 bzip60-2植物在不同MDT的生殖阶段生长植物有多种系统来保护自己免受热胁迫。在合成过程中，热干扰蛋白质的正确折叠，导致错误折叠蛋白质的积累。细胞质中的HSR系统和内质网中的UPR都能感知到错误折叠蛋白的存在，并采取行动减轻热应激带来的损伤。在本研究中，作者发现ER的UPR和细胞质HSR之间可能存在联系（图9）。UPR和HSR通常被认为是相互独立的。两者都对热有反应，但在不同的细胞空间，所以问题是这两个系统之间是否有联系。
图9 UPR和bZIP60在玉米热胁迫反应中的作用的模型在作者构建的玉米系统中，IRE1的热激活导致bZIP60 mRNA的剪接。bZIP60激活a型HSF HSFTF13的表达，从而上调HSP基因的表达。作者发现HSFTF13只是玉米B73中25个HSF基因中的一个，其中15个是A组HSF，可以激活HSP基因的表达。尽管HSFs数量众多，但拟南芥中的HSFTF13在脱落酸响应和耐热性方面发挥着关键作用。此外，在作者的系统中，bZIP60 -2中bZIP60的沉默会影响HSFTF13的表达，导致植物对高温更加敏感。总的来说，作者在一个温暖的夏季模拟环境温度升高时，作者发现W22玉米的HSR被激活，并且在较高的MDT下被激活的更多。高温也激活了IRE1，导致了可靠的UPR生物标志物bZIP60 mRNA的剪接（图9）。然而，只有少数UPR基因在高温下上调，而bZIP60的其他常见靶点没有上调。一个bZIP60敲低突变体被发现对热胁迫更敏感，并且在较高的MDT下经历更早的衰老。一种重要的HSF在热应激反应中的上调依赖于bZIP60和许多热休克蛋白。没有在bzip60-2中启动一个成熟的高铁可能是解释突变体对热敏感的一个原因。
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