PCR实验原理及步骤PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 实验方法原理①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR反应体系10×扩增缓冲液 10 ul 4种dNTP混合物 各200 umol/L 引物 各10～100 pmol 模板DNA 0.1～2 ug Taq DNA聚合酶 2.5 u Mg2+ 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100 ul 模板制备（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 （2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 （3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。 PCR反应条件控制1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。 2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。 3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。 4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。 5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。 6. 反应温度 （1）变性温度和时间95℃，30 s。 （2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。 （3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。 （4）Tm值=4(G+C) +2(A+T) 7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。 |
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