Illumina Hiseq/Miseq测序原理简介

一、Solexa测序技术前世今生（——Illumina平台）

Solexa高通量测序技术是由英国剑桥大学派生的Solexa公司建立起来的。该方法以单分子阵列技术为基础，是对合成测序技术的发展与延伸。

二、测 序 原 理

Solexa是一种基于边合成边测序技术（Sequencing-By-Synthesis，SBS）的新型测序技术。通过单分子阵列实现在小型芯片（FlowCell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光集团，捕获激发光，从而读取碱基信息。

1）Flow Cell结构

Flow Cell结构示意图

2）可逆阻断技术

可逆阻断原理示意图

3）边合成边测序（SBS）

边合成边测序示意图

a.加入测序引物

b.Cycles1

a)合成第一个碱基

b)清除未反应的碱基和试剂

c)激发荧光信号并读取 （可逆阻断技术的步骤）

d)去除荧光基团和阻断基团 （可逆阻断技术的步骤）

c.Cycle2……Cycle n

4）桥式PCR（——簇生成之“起始延伸”）

起始延伸步骤示意图

5）桥 式 PCR（——簇生成之“扩增”）

簇生成示意图

6）桥 式 PCR（——簇生成之“测序”）

测序示意图

7）碱基读取

碱基读取示意图

三、工作流程

Illumina测序仪工作流程

四、测 序 类 型

a)单端测序（single-read sequencing，SR）

b)双端测序（Paired-endsequencing，PE）

c)混样测序（Indexsequencing）

1）FollowCell 接头差异

Paired End

Paired End

Uracil Specific Excision Reagent (USER)

尿嘧啶切割位点

FormamidopyrimidineGlycosylase (fpg)

糖基化酶切割位点

Single Read

Single Read

Periodate Linearization

高碘酸盐切割位点

a）双 端 测 序

Paired-End sequencing（PE/双端测序）

−检测基因片段两端的基因信息。

双端测序示意图

b）单 端 测 序

Single-read sequencing（SR，单端测序）

−只检测基因片段一段的基因信息。

单端测序示意图

c）混 样 测 序

Index Sequencing：将多种样本混合测序

−充分利用solexa高通量测序特点。

混样测序示意图

A：Adapter

B：Fragment DNA

C：Index seq primer

D：Index

E：Adapter

测序过程示意图

五、仪 器 构 造

1）Miseq测序仪

Miseq测序仪示意图

Hiseq侧测序仪

六．测序结果展示

Fastq：Fastq是Solexa测序技术中一种反映测序序列的碱基质量的文件格式。

·Read 1

Read1测序结果示意图

·Read 2

Read2测序结果示意图

碱基质量示意图

测序结果的解释