多重PCR的一个关键点在于反应体系的平衡。即使多重PCR体系内每对引物的特异性都很好,在单重PCR测试中扩增效果也非常好,但到了多重体系中却经常出现某些目标产物扩增不出来的现象。原因就在于反应体系的不平衡,这种不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增,获得大量的扩增产物,而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂(SantaLucia,
2007)。所以,随着扩增产物的大量出现,聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制住了,因此,前期处于劣势的引物及其模板,这时就更加举步维艰了,最终导致扩增产物量非常之小,以至于无法检测。正所谓'强者更强、弱者更弱'。而导致反应体系不平衡的因素很多,限于个人知识水平以及目前多重PCR引物设计理论发展的程度,这里列举我所知道一些因素:
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