【原】5+甲基化联合转录组分析，谁用谁高分！

导语

Identifcation of key methylation diferentially expressed genes in posterior fossa ependymoma based on epigenomic and transcriptome analysis.

基于表观基因组和转录组分析的后颅窝室管膜瘤关键甲基化差异表达基因的鉴定

结果解读

1.EPN-PF相关DMGS的鉴定

作者从GEO数据库下载了两个微阵列数据集。数据集（GSE66354）包括外科肿瘤和正常大脑样本的基因表达谱（n = 149），其中包括EPN-PFA（n = 29）和EPN-PFB（n = 26）样本。此外，作者还从43例EPN-PFA和12例EPN-PFB患者的数据集中获得了DNA甲基化谱（GSE114523）。本研究的工作流程如图1所示。

图1.流程图

2.EPN-PF相关DMGS的鉴定

通过分析GSE66354数据集，作者发现在两种EPN-PF亚型之间的所有1337个DEG，其中712个基因上调，625个基因下调。图2a和b中提供了前10个上调和下调DEG。在GSE114523的甲基化分析数据集中，作者发现了1873个高甲基化基因和1164个低甲基化基因（图2c）。然后使用维恩图揭示了63个甲基化相关的高表达基因和83个甲基化相关的低表达基因（图2d）。

图2.EPN-PF相关dmg的鉴定

3.GO和KEGG通路分析和PPI分析

为了进一步研究与疾病发生发展相关的生物学功能和信号通路，作者通过GO、KEGG和PPI分析了甲基化相关的高表达基因和甲基化相关的低表达基因。图3a和c显示了重要的GO项和KEGG途径。如GO分析所示，EPN-PF相关DMGs在细胞外基质组织、适应性免疫反应和膜筏中显著富集。此外，作者发现KEGG分析显示，粘着斑、NF-κB通路和轴突导向通路显著富集。通过PPI网络分析，作者得到了两个重要的模块，如图3b和d所示。

图3.GO和KEGG通路分析和PPI分析

4.WGCNA分析和枢纽模块的识别

如图4a所示，样本聚类显示由于异常值，样本GSM1620246需要从后续分析中移除。随后，作者将剩下的54个样本纳入WGCNA分析，并确定了9个关于β阈值功率的模块 = 9（图4b-d）。其中，作者发现蓝色模块由805个基因组成，与EPN定位高度相关（R = 0.69，p = 1e−08，图4e）。通过图4f，作者通过蓝色模块中GS和MM系数选择了180个hub基因。

图4.加权基因共表达网络分析(WGCNA)

5.EPN-PF相关 hub DMGs的识别

通过上述筛选，作者比较了EPN-PF相关的DMG和作者在WGCNA中获得的蓝色模块相关基因，并确定了5个基因为EPN-PF相关的关键DMG：ATP4B、CCDC151、DMKN、SCN4B和TUBA4B（图5a–g）。

图5.EPN-PF相关关键DMGs的识别

6.免疫组化法检测EPN-PF相关hub-DMGs表达

用IHC法检测上述hub-DMGs的表达水平，验证了生物信息学分析结果的可靠性。首先，作者确定了作者获得的肿瘤的亚型（图6）。如图7所示，与EPN-PFB相比，EPN-PFA中的ATP4B、CCDC151、DMKN和SCN4B水平降低，这与预测一致。SCN4B除外（P = 0.1579），其他三组间差异有统计学意义（P < 0.05).

图6.EPN-PF两种亚型的鉴定

图7.两种EPN-PF亚型基因表达的比较

7.通路富集分析

为了探讨关键分子在TME免疫细胞浸润中的作用，作者评估了两种亚型EPN-PF样本中28个TME细胞浸润的情况。如图8a所示，两种亚型之间的免疫细胞存在显著差异。为了进一步探讨EPN-PF相关的5个hub-DMGs与TME浸润细胞的关系，作者将其与TME浸润细胞进行了相关性研究。Spearman相关分析显示这些基因与TME浸润细胞之间存在显著相关性（图8b）。在图8b中，作者可以直接看到TUBA4B与浆细胞样树突状细胞（pDCs）呈显著正相关，SCN4B、DMKN和CCDC151与T细胞浸润呈显著负相关。ATP4B与趋化因子受体（CCR）呈显著负相关。接下来，作者使用GSVA来确定在这五个基因中富集的途径。在这五个基因的丰富通路中，作者发现了几个与肿瘤发生、发展和预后相关的重叠和显著不同的通路：PI3K-Akt-mTOR、TNFα-NFKB和缺氧（图9a-e）。

图8.富集分析

图9.GSVA分析

小结

在本研究中，作者首先通过转录组、甲基化和WGCNA的联合分析，确定了EPN-PFA和EPN-PFB之间的关键差异基因，然后分析了关键差异基因与免疫途径之间的关系，试图探讨免疫相关途径在预后中的作用和影响。通过使用表达谱和甲基化谱进行多组学分析，并发现这些DMGs与肿瘤的发生、发展以及细胞外基质组织、神经炎症反应和NF-κB信号通路等免疫反应途径密切相关，可能参与室管膜瘤的发生发展。