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1. 细胞裂解要采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质与蛋白质的相互作用，多采用非离子去垢剂(NP40 或Triton X-100)，不能用高浓度的去垢剂(0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，通常Leupeptin和Aprotinin这两种即可，若蛋白较大，可加胰蛋白酶抑制剂(PMSF)，若涉及到磷酸化信号转导，要加磷酸化抑制剂(如Na3VO4)。同时全程冰上操作。 2. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。 3. 使用对照抗体如小鼠的IgG，可以排除非特异性结合的情况，若存在假阳性结果和非特异性蛋白，可尝试降低抗体浓度，或更换特异性高的抗体。 4. 若没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或信号太弱，可尝试降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类;选择亲和性更高的抗体或者过表达以提高目的蛋白的含量;若是目的蛋白受亚细胞定位的影响，则需重新选择裂解液配方以释放目的蛋白。 |
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