编者按：2019年12月9日至13日，一年一度的AET（Antibody Engineering & Therapeutics）在美国圣地亚哥举行。AET是抗体药研发领域最重要的学术盛会之一。本篇主要回顾与肿瘤免疫疗法有关的几个讲座。本系列报道由“华人抗体”公众号和“礼来亚洲资本”公众号同步推送。
里程碑 | 2019 AET会议上的华人抗体协会专场圆满成功
三类肿瘤
Defining the Light at the End of the Tunnel: Biologic Problems and Engineering Solutions in Cancer Immunotherapy
Daniel S. Chen, M.D., Ph.D., Chief Medical Officer, IGM Biosciences
Session: Reverse Translation: Antibody Engineering, Clinical Data and Lessons from Cancer Immunotherapy
Wednesday, 12/11/2019
Dr. Daniel Chen是世界肿瘤免疫领域的权威之一。他在基因泰克工作过12年，曾经负责癌症免疫疗法的全球开发。2018年8月，Dr. Chen离开基因泰克，加盟IGM Biosciences并担任首席医学官一职。他和前基因泰克同事Ira Mellman近年来发表了一系列肿瘤免疫综述。这些文章颇具影响力，被广为引用，引导了这一领域的前沿理论。
Dr. Chen的演讲激情四射。他的讲座条理清晰，引人入胜。该演讲的部分内容在2020年1月的《Immunity》综述（参考资料2）中有比较详细的阐述。 Dr. Chen探讨的主要问题是，癌症免疫疗法对某些患者非常有效，但为什么对其余的80%患者帮助不大？
肿瘤细胞千方百计想要抑制或逃逸免疫系统的攻击，因而演化出几种不同策略。根据肿瘤细胞与免疫细胞的空间分布，实体瘤大致可分为三大类（我给它们起了比较形象的中文名字）：
1） “西瓜型”（inflamed）肿瘤 ：在这类肿瘤中，CD8+ T细胞已大量渗入肿瘤内部，好像西瓜瓤中的西瓜籽一样分布其中，但由于免疫检查点等机理，它们的杀伤作用被肿瘤细胞抑制。这类肿瘤以活跃的IFNγ信号为主要分子表征。Anti-PD1/PD-L1或其它检查点抑制剂对这类肿瘤治疗比较有效。非小细胞肺癌（NSCLC），黑色素瘤和肾细胞癌以“西瓜型”肿瘤为主。
2） “围城型” (immune excluded) 肿瘤 ：在这类肿瘤中，CD8+ T细胞出现在肿瘤边缘，但围而不攻，没有渗入进肿瘤内部。这类肿瘤以活跃的TGF β信号为主要分子表征，可能的机理包括肿瘤周围形成以纤维细胞或基质细胞为主的护城河。胃癌、结肠癌和胰腺癌以“围城型”为主。
3) “沙漠型”（immune desert）肿瘤 ：这类肿瘤的内部和周边没有任何免疫细胞，成为免疫沙漠。在这种情况下，肿瘤细胞没有引起免疫系统的任何注意。一种可能的机理是肿瘤周围形成低氧、酸性的微环境（TME），影响了抗原呈递和免疫系统激活。其它可能机理还包括肿瘤细胞不产生或掩盖住了具有免疫原性的抗原。小细胞肺癌（SCLC）、激素受体阳性的乳腺癌（HR+ BC）和前列腺癌以“沙漠型”为主。
图1. 按与免疫细胞的空间关系分类的三类肿瘤。抗肿瘤免疫周期在哪些环节出了差错，决定了肿瘤的类型。
图片来源：Dr. Chen's talk
图2. 免疫类型在各种肿瘤中的分布。竖轴为肿瘤突变负担（TMB），横轴为按组织分类的不同肿瘤。每一圆盘代表一种肿瘤，其大小代表该癌症的相对全球发病率，红色部分代表“西瓜型”（inflamed），蓝色部分代表“围城型” (immune excluded)，而灰色部分代表“沙漠型”（immune desert）。CRC， 结直肠癌；MSS，微卫星稳定；HR+ BC, 激素受体阳性乳腺癌; NSCLC，非小细胞肺癌；RCC, 肾细胞癌; SCLC, 小细胞肺癌；TNBC, 三阴性乳腺癌；UBC，尿路上皮膀胱癌。
图片来源：参考资料2
单一地依靠检查点抑制剂来治疗围城型和沙漠型肿瘤很难取得满意的效果，需要和其它疗法联用。这里我们从AET2019的报告中选取几个例子，探讨一下适合不同类肿瘤的免疫疗法。
例子1：同时靶向PD-L1和TGF-β，针对“围城型”肿瘤
Tumor in the Crossfire: Targeting PD-L1 and TGF-beta with Bintrafusp Alfa
James L. Gulley, M.D., Ph.D., Chief, Genitourinary Malignancies Branch, Director, Medical Oncology Service, Center for Cancer Research, NCI, NIH
Session: Reverse Translation: Antibody Engineering, Clinical Data and Lessons from Cancer Immunotherapy
Wednesday, 12/11/2019
既然TGF β是围城型肿瘤的主要分子表征，那如果将TGF β抑制剂和PD-1 / PD-L1抑制剂联用，是否可以让免疫细胞破城而入，来更有效地清除肿瘤细胞呢？动物数据和临床数据显示，通过单抗抑制TGF β可以让更多的T细胞进入肿瘤内部，并提高anti-PD-L1的疗效。
延续同一思路，EMD Serono (德国默克在美国的子公司) 开发了Bintrafusp Alfa或M7824蛋白药。M7824是一个同时靶向PD-L1和TGF β的双功能分子。其基本骨架实际上是已经上市的Avelumab (Bavencio)，一个由默克和辉瑞推出的anti-PD-L1的IgG1抗体药。Avelumab的重链基因被延长，增加的DNA序列编码一个连接链和TGF β二型受体的膜外结构域（TGF- βRII）。因此而形成的M7824融合蛋白既有双价anti-PD-L1抗体功能，又有双价TGF β结合功能。M7824具有以下几个优势或特点：
1） 两个TGF- βRII成为TGF β的捕捉器，但结合后又不引起TGF β信号传导。
2） 这个捕捉器对TGF β三种亚型都适用。
3） TGF β在细胞外是以双聚体的形式为主，而两个TGF- βRII结构域在同一分子中空间的分布又便于M7824捕捉TGF β双聚体，这使得M7824对TGF β拥有较强的总亲和力（avidity)。
4） M7824通过anti-PD-L1结合肿瘤细胞表面的PD-L1后，在细胞附近捕捉TGF β，特异性地阻断了TGF β自分泌或旁分泌作用。M7824的anti-PD-L1机构域和TGF- βRII结构域因而有协同效应，而不仅仅是anti-PD-L1功能和anti-TGF β功能的简单叠加。
5） M7824对TGF β信号通路的抑制作用只局限在肿瘤微环境（TME）中，降低了药物的副作用。
6） 和TGF β抗体相比，TGF- βRII的毒性更小。
7） 与两个蛋白药联合用药相比，靶向双通路的单一分子减少了临床开发的复杂性。
图3. Bintrafusp Alfa或M7824的分子结构。两个TGF- βRII结构域可以同时结合TGF β双聚体。
图片来源：参考资料3
图4. Bintrafusp Alfa或M7824的作用机理。
图片来源：Dr. Gulley's talk
来自NIH的Dr. Gulley在报告中重点回顾了Bintrafusp Alfa的一些临床数据。在2线非小细胞肺癌（NSCLC）的一期临床试验中, 最高剂量组（每两周注射一次1200毫克，n=40）的客观响应率（ORR）为25%，疾病控制率（DCR）为47.5%。在PD-L1表达水平高（>=80%）的亚组中，高剂量M7824的疗效尤为显著——取得了85.7%的ORR，15.2个月的无进展生存时间（PFS）。在另一个一期临床试验中，M7824在与HPV有关的癌症中（包括宫颈癌、肛门癌和头颈部鳞状细胞癌）取得了34.9%的临床响应率（n=43），其中有两名宫颈癌患者获得完全缓解（CR）。这些数据优于anti-PD-1在这些癌症中的历史临床数据（ORR为13% - 24%）。
图5. M7824在2线非小细胞肺癌（NSCLC）一期临床试验中的初步数据分析。患者（n=80）按PD-L1表达水平高低分为三个亚组，接受500毫克或1200毫克（每两周）两种剂量。肿瘤萎缩超过30%为部分缓解（PR）。
图片来源：Dr. Gulley's talk
目前，M7824正在进行更多的二期临床试验。我更期待看到它在围城型癌症（胃癌、TNBC、结肠癌和胰腺癌）中的疗效数据。
例子2：靶向糖免疫检查点，针对所有类型肿瘤？
Siglec Ligand Degradation with EAGLE Enzyme-Antibody Fusion Platform to Treat Cancer
Jim Broderick, M.D., CEO and Founder, Palleon Pharmaceuticals
Session: Preclinical Development of Antibody-based Therapeutics
Thursday, 12/12/2019
肿瘤细胞的一种免疫逃逸机制是在其表面种满了“树”。这些树就是唾液酸聚糖（sialoglycan）。免疫细胞表面上分布着各类唾液酸聚糖的受体——Siglecs。迄今为止，人体中共发现有14种Siglecs，每种受体结合一大类唾液酸聚糖。与一般的配体-受体结合不同，Siglec-sialoglycan的结合不要求结构的精准配对，而是多点、多价位的弱作用的汇总。唾液酸聚糖的密度越高，两者的总结合力 (avidity) 也越强。结合后的Siglec向细胞内发送信号，抑制免疫激活。近期越来越多的研究表明，大多数晚期肿瘤使用Siglec-Sialoglycan轴抑制了抗肿瘤免疫周期的各个阶段。细胞表面过度唾液酸化（hypersialylation）是很多肿瘤的主要表征之一。表面被“树林”覆盖的癌细胞被免疫系统当成了正常细胞。
图6. Siglec-Sialoglycan轴是癌症免疫抑制的主要机制。
图片来源：Broderick's talk
不同的公司在采取不同的策略来解禁Siglec-Sialoglycan轴造成的免疫抑制。陈列平博士创立的NextCure公司研发了靶向Siglec-15的单抗药NC318，正在开展1/2期临床试验评估它在晚期或转移性实体瘤患者中的安全性和疗效。而Palleon Pharmaceuticals除了开发靶向Siglec受体的单抗药外，还建立了EAGLE （Enzyme-Antibody Glyco-Ligand Editing）技术平台，用于开发酶-抗体双功能蛋白药，特异性地剪除癌细胞表面的聚糖分子末端的唾液酸。用Palleon的CEO Dr. Jim Broderick的话来说，EAGLE蛋白药清除了癌细胞防护林的树叶，只留下光秃秃的枝干。此时的聚糖无法再和Siglec结合，使癌细胞暴露在适应性及先天性免疫细胞的视野内和炮火下。
Dr. Broderick在本次报告中重点介绍了EAGLE技术。一个典型的EAGLE分子以单抗分子为基本骨架：抗体的一只结合臂仍然能够靶向肿瘤细胞表面抗原，比如HER2，而另一只结合臂则被替换成唾液酸酶。这种一手抓、一手剪的格式被命名为 “Janus” (古罗马传说中负责开始和结局的神，他的头部前后各有一张脸)。EAGLE蛋白药还有另外两种格式：龙虾式 （ “Lobster”）和猛禽式（ “Raptor”）, 每个分子有两个抗原结合臂和两个唾液酸酶。
图7. Palleon公司的EAGLE技术。
图片来源：Broderick's talk
EAGLE技术的优势是不管癌细胞表面唾液酸聚糖的组成和分布，都可以用它改变肿瘤微环境。它能把任何一个现有的癌症单抗药转变为免疫肿瘤药。
虽然EAGLE候选药还没有进入临床阶段，但Palleon团队通过大量的细胞、小鼠和猴子试验初步证明了EAGLE技术的潜力和安全性。在小鼠模型中，靶向HER2的EAGLE-302比Herceptin显示出了更强的抗肿瘤效果，而且这种效果依赖于唾液酸酶的完整功能。与anti-PD1联用后，EAGLE-302在HER2低表达的乳腺癌小鼠模型中取得了完美疗效——6只小鼠的肿瘤全部消失，而注射Herceptin的对照组的肿瘤则无一萎缩。EAGLE-408 (EAGLE-302中的细菌唾液酸酶被升级为人源唾液酸酶) 确实改变了TME：在小鼠中它不但增加了肿瘤中渗入的CD3+、CD4+或CD8+ T细胞数量，激活了肿瘤中的CD8+ T 细胞，还显著加强了NK细胞的渗入，减少了免疫抑制性的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的数目。在人源细胞TME模型中，与K药相似，EAGLE分子诱导了代表免疫激活的几个细胞因子：IFN γ, IL-17A, IL-2, IL-6和TNF α。
图8. 在小鼠乳腺癌模型中，靶向HER2的EAGLE-302与anti-PD1联用取得最好疗效。
图片来源：Broderick’s talk
Palleon计划于2021年启动EAGLE药物的临床试验。
例子3：用“合成免疫” （synthetic immunity）来攻克围城型或沙漠型肿瘤
Understanding T-cell Bispecifics in the Clinic Using Biomarkers
Meghna Das Thakur, Senior Biomarker Scientist, Genentech
Session: Reverse Translation: Antibody Engineering, Clinical Data and Lessons from Cancer Immunotherapy
Wednesday, 12/11/2019
在很多情况下，我们无法用调控内源性免疫的方法来攻克围城型或沙漠型肿瘤，这时我们可以求助于合成免疫。CAR-T细胞疗法和双特异性T细胞衔接蛋白（BiTE）就是合成免疫的两个例子：把改造过的或天然的T细胞的杀伤火力直接导向肿瘤细胞。如果说使用免疫检查点抑制剂还讲究些阴阳平衡、刹车油门，那合成免疫疗法则是火力大开、粗暴凶猛。也许只有这种疗法才能破了沙漠型肿瘤的局。但随之而来的是合成免疫的更大的毒性和副作用——与检查点抑制剂相比，CAR-T和BiTE更容易引起细胞因子风暴（CRS）。因此，如何降低CRS风险是设计合成免疫疗法的一个重要考虑因素。
Dr. Thakur在她的报告中就介绍了一个由基因泰克/罗氏开发的衔接肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体Cibisatamab。每一个Cibisatamab抗体分子可以结合两个癌胚抗原（CEA），还可以同时单价结合T细胞上的CD3e（T细胞受体/TCR复合物的一个亚单位）。结合CD3e、激活T细胞只有在Cibisatamab结合表面高度表达CEA的肿瘤细胞之后才会发生，降低了抗体分子在血液循环中激活免疫系统的风险。CEA在结直肠癌中高度表达，在肺癌、胰腺癌和胃癌中中度表达。Cibisatamab可以单独用药，也可以与anti-PD-L1联用。
图9. Cibisatamab分子结构和特点。
图片来源：Dr. Thakur’s talk; www.biooncology.com/pipeline-molecules/cea-tcb.html
Cibisatamab具有以下几个特点或优势：
1） 每个抗体分子有两个不同的重链和两个不同的轻链。在生产中，它们之间的正确配对是通过CrossMAb和“knob-into-hole”两个技术实现的。
2） 抗体分子具有全长的Fc区，并通过改造使其变成免疫“沉默“，不会引起ADCC或CDC等作用。但Fc又保留了与FcRn的结合位点，使Cibisatamab拥有与其它全长单抗药相似的体内半衰期。
3） 由于对CEA的双价结合，肿瘤细胞表面上的CEA密度越高，Cibisatamab越容易与其结合。这使Cibisatamab能够更好地区分肿瘤细胞和低度表达CEA的正常细胞。
4） Cibisatamab与CD3e的结合力不强，避免了它非特异性地激活T细胞。
5） CEA结合域与CD3e结合域之间的距离很短，便于把T细胞拉近拉紧，进而更有效地杀伤肿瘤细胞。
图10. Cibisatamab的作用机理。
图片来源：www.biooncology.com/pipeline-molecules/cea-tcb.html
在动物实验中，Cibisatamab注射后24小时就可以观察到大量的T细胞涌入肿瘤内部，并引起肿瘤细胞凋亡。这种现象也同样在临床患者体内出现。在针对微卫星稳定（microsatellite stable, 或MSS，表明该肿瘤细胞DNA错配修复功能完整，肿瘤突变负担低）的转移性结直肠癌（mCRC）的一期临床试验中，患者在给药24-48小时后可检测到肿瘤由于免疫细胞的入侵而变大。在另一个一期mCRC剂量爬坡试验中，与Tecentriq (atezolizumab, anti-PD-L1) 联用，Cibisatamab在高剂量组（80mg和160mg）中显示出良好的安全性和治疗效果，多数患者达到了部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）。
图11. 在小鼠模型中，Cibisatamab把沙漠型肿瘤转变为西瓜型肿瘤。
图片来源：参考资料1
基因泰克/罗氏目前正在开展多个一期临床试验，探索Cibisatamab单独或联合用药在更多肿瘤中的应用。
参考资料：
1. Bacac, M., et al. (2016). "CEA TCB: A novel head-to-tail 2:1 T cell bispecific antibody for treatment of CEA-positive solid tumors." Oncoimmunology 5(8): e1203498.
2. Hegde, P. S. and D. S. Chen (2020). "Top 10 Challenges in Cancer Immunotherapy." Immunity 52(1): 17-35.
3. Lan, Y., et al. (2018). "Enhanced preclinical antitumor activity of M7824, a bifunctional fusion protein simultaneously targeting PD-L1 and TGF-beta." Sci Transl Med 10(424).
