 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由活化的中性粒细胞释放的DNA组蛋白和蛋白质组成的网状结构，其在中性粒细胞介导的固有免疫反应中占据了主导地位。NETs也与自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病等，以及其他的非传染性病理过程，如凝血障碍、血栓形成、糖尿病，动脉粥样硬化、血管炎和癌症的发病机制相关。近年来，已有大量动物模型和肿瘤患者数据表明，NETs参与了肿瘤的进展和转移。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞募集的中性粒细胞（肿瘤相关中性粒细胞）和NETs的形成有密切的联系。这种联系在原发性肿瘤和肿瘤转移灶中均有发现。NETs能捕获循环中的肿瘤细胞并促进肿瘤的转移。NETs能够唤醒休眠的肿瘤细胞，促进肿瘤的复发和转移。Maria Teresa Masucci于2020年在《Frontiers in immunology》上发表综述关注了NETs促肿瘤发生的原理，及其成为肿瘤治疗潜在靶点的可能。 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由Volker-Brinkmann和Arturo Zychlinsky在2004年发现的炎性细胞死亡方式,它能够诱捕细菌、真菌、原虫和病毒。NETs由活化的中性粒细胞分泌，由DNA纤维、组蛋白和抗菌蛋白组成，可以固定病原体并将其暴露于局部高致死性浓度的效应蛋白。Zychlinsky等人证明了NETs可以杀死细菌，从而定义了一种新的抗菌固有反应。 除了作为机体的防御机制外，NETs在非传染性疾病中也起着关键作用，如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，囊性纤维化和银屑病。NETs还参与了其他病理过程，如凝血障碍，血栓形成，糖尿病，动脉粥样硬化，血管炎，伤口愈合和牙周炎等。近年来，许多研究将目光转向NETs在恶性肿瘤中的作用，包括NETs与肿瘤免疫、进展、转移、以及与其相关的血栓形成的关系。NETs有抗肿瘤和促肿瘤的双面作用。NETs的成分，如髓过氧化物酶（MPO）、蛋白酶和组蛋白可以杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长和转移。NETs的蛋白酶能降解细胞外基质，促进肿瘤细胞扩散和转移。 既往研究显示，NETs能够包裹并黏附肿瘤细胞，进一步促进肿瘤的播散转移。有研究在动物模型以及肿瘤患者外周血和肿瘤组织中找到NETs，其作用仍未完全明确。循环中的NETs可损伤肿瘤患者的器官，其机制类似于自身免疫性疾病，还有研究证明NETs可以唤醒休眠的肿瘤细胞。 这篇综述主要关注NETs的促肿瘤发生的原理，及其作为癌症治疗潜在靶点的可能。 中性粒细胞分泌NETs的过程被称为NETosis，即为中性粒细胞的炎性细胞死亡方式。该过程涉及不同的信号和机制。Grayson和Kaplan提出活性氧（ROS）的产生，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）向核迁移、抗髓过氧化物酶抗体（MPO）、组蛋白修饰和染色质降解是形成NETs的核心机制。Sørensen和Borregaard提出了体外和体内NETs形成的不同途径，组蛋白瓜氨酸化的肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）和核小体降解是体内NETs形成的核心步骤。 不同于细胞凋亡和坏死，NETs的形成是一种细胞死亡。前者是染色质降解和颗粒物释放到细胞外空间的过程。NETs的形成通常需要中性粒细胞的激活以及NADPH氧化酶产生ROS。有研究阐述了线粒体DNA可形成NETs，由于细胞核DNA的数量是线粒体DNA的100000倍，并且线粒体在中性粒细胞中很少，这种差异是否有作用，有待进一步研究。 除了传染病和非传染病，在肿瘤微环境中也有NETs的形成。恶性肿瘤中NETs形成的诱因包括肿瘤细胞集落刺激因子（G-CSF）和内皮细胞IL-8。肿瘤中G-CSF的过表达可升高血液中中性粒细胞数量，生成ROS并致NETs形成。Gupta等人发现了活化内皮细胞（ECs）和中性粒细胞能通过IL-8部分介导NETs形成。胰腺癌（PaCa）细胞能够直接或者间接诱导NETs形成。 动物模型以及肿瘤患者的血液以及肿瘤组织中都有NETs的存在。NETs具有促肿瘤和抗肿瘤的双面作用，取决于免疫系统的状态以及肿瘤微环境的相互作用。有研究致力于NETs的形成与肿瘤发生、进展和转移之间的关系，并揭示了NETs通过蛋白酶或激活信号对肿瘤细胞增殖的直接作用。肿瘤细胞可以在体内以及体外诱导NETs的形成，此外，有研究证实了肿瘤微环境中的肿瘤相关中性粒细胞（TANs）与NETs形成有关。 下文将重点关注NETs在肿瘤模型以及肿瘤患者的影响。 研究表明肿瘤细胞可以诱导中性粒细胞释放NETs。相较于正常对照组，在慢性粒细胞白血病，乳腺癌和肺癌的小鼠模型循环中的中性粒细胞更易释放NETs。肿瘤对机体系统性影响导致了中性粒细胞形成NETs的活性升高。 有研究者在转基因小鼠肿瘤模型（RIP1-Tag2胰岛素瘤与MMTV-PyMT乳腺癌）中发现高度的血管病变，心脏以及肾脏中性粒细胞浸润，以及类似于肿瘤诱发的系统性损伤。此外，在肾脏中发现的血小板-中性粒细胞复合物，侧面反应了NETs的形成。NETs导致的荷瘤小鼠血管功能受损可以通过DNA酶治疗使肾血管功能达到健康小鼠的水平。NETs和血小板在诱发胰腺癌（C57/Bl6小鼠模型和患者）相关高血糖中扮演着关键的角色，并与静脉血栓和癌症相关血栓有关。 体外研究显示，胰腺癌细胞系（AsPC-1）可以通过剂量依赖性诱导NETs形成。NETs形成主要归因于AsPC-1条件培养基（CM）的蛋白质组分。NETs能增强内源性正常血浆凝血酶电位（ETP），与肿瘤细胞迁移、浸润和血管生成有关。Lewis肺癌（LLC）细胞外RNA（exRNA）也可以诱导NETs形成。 自发性肠道肿瘤的发生与具有促肿瘤N2表型的低密度中性粒细胞的积聚，补体C3a的受体上调和NETs形成有关。 NETs在促肿瘤转移中的作用非常重要。研究显示，NETs可以捕获循环肿瘤细胞（CTCs）并促进肿瘤的转移。在模拟手术后的炎症环境的肿瘤小鼠模型中，发现了NETs黏附CTCs的基础是：NETs黏附肿瘤细胞，β1-整合素表达上调以及β1-整合素对肿瘤细胞和NETs的作用。DNA酶可以降低肿瘤细胞与NETs的粘附作用。在小鼠模型中，NETs形成和捕获循环肺肿瘤细胞导致肝脏微转移灶增多。此外，NETs能够促进手术后肝转移的发生。  Tohme等人发现NETs可以通过增强自身线粒体功能促进肿瘤细胞生长。皮下移植瘤在WT组小鼠生长快于PAD4-KO组小鼠，PAD4-KO组小鼠与WT组小鼠比较，肝转移较少。WT小鼠腹腔注射DNA酶后得到了类似的结果。与WT小鼠相比，PAD4-KO肿瘤组织的免疫荧光染色后，肿瘤组织显示非常低的中性粒细胞浸润。体外研究观察查到，在乏氧肿瘤细胞环境下，通过高滴度的趋化因子和HMGB1可介导中性粒细胞募集体，诱导肿瘤微环境中NETs形成。总而言之，这些研究强调了中性粒细胞募集和NETs的形成在肿瘤生长和进展过程中的核心地位。 Park等人强调了肿瘤细胞的转移与中性粒细胞募集以及NETs形成的密切关系。他们发现，转移性乳腺癌细胞能够刺激NETs生成。CXCL1介导了原位种植4T1（转移性）和4T07（非转移性）小鼠乳腺癌细胞小鼠肿瘤组织中的中性粒细胞募集。原发性4T1肿瘤相较于4T07肿瘤，中性粒细胞更多。降低4T1细胞中CXCL1水平可以减少肿瘤组织中中性粒细胞的浸润。小鼠肺组织切片NETs的免疫荧光染色标本中，NETs形成发生在尾静脉注射4T1细胞后。此外，G-CSF能够介导转移性肿瘤细胞在扩散部位诱导NETs形成；而抗G-CSF阻断抗体则大大降低了4T1细胞介导的NETs形成。 除了上述机制外，NETs还能“唤醒”休眠的肿瘤细胞并介导肿瘤转移。最近，Albrengues等人证明了NETs在肿瘤复发中作用。在小鼠模型中阐明了休眠肿瘤细胞苏醒并发生转移的机制。由吸烟或脂多糖滴鼻引起的肺部炎症，导致NETs形成，可诱导肺转移，这种现象可以通过体内或体外给予DNA酶降解NET-DNA得到抑制。此外，NETs通过整合素激活与FAK/ERK/MLCK/YAP信号转导结合细胞外基质，导致层粘连蛋白断裂以及新的肽链结合位点重塑唤醒休眠细胞。 多种技术可以用于检测NETs与肿瘤细胞间的粘附作用。Monti等人阐述了各种肿瘤细胞系（HT1080、U 87 MG、H1975、DU 145、PC-3和A-431）在体外通过细胞表面α5β1, αvβ3，和αvβ整合素的表达，粘附于中性粒细胞样细胞形成NETs。循环中高水平RGD肽可以抑制肿瘤细胞与NETs的粘附，抑制率与DNA酶治疗的结果相似。这种方法可以用于对表达RGD整合素的肿瘤细胞对于NETs的粘附能力筛选。 NETs在人类肿瘤中也与肿瘤进展和转移相关肿瘤患者（包括肺，胰腺，膀胱癌）血浆中NETs的水平高于健康对照组。在肺癌患者中，Li等人发现NETs存在于在肺组织、外周血和痰液。此外，在结直肠癌患者中，中性粒细胞体外刺激后产生的NETs量显著高于健康对照组，且与不良临床预后相关。 Park等人通过免疫荧光染色发现了乳腺肿瘤组织中的NETs。在三阴性乳腺癌肺转移灶中NETs阳性率最高。Tohme等人发现，与正常肝脏相比，TANs和NETs在结直肠癌肝转移患者根治性切除术后肿瘤组织样本中阳性率更高。同样，肿瘤组织表达高水平的瓜氨酸组蛋白，提示了NETs的形成。与健康对照组相比，肿瘤患者术前MPO-DNA水平(一项可靠的系统性NETs形成程度标志物)更高。并与更差的DFS和OS相关。因此，血清MPO-DNA水平可以作为预测这些患者预后的生物标志物。 在患者肿瘤组织中，TANs与NETs形成的关系及其在肿瘤免疫编辑中的作用一直受到关注，尤以小儿尤文肉瘤为甚。Berger Achituv等人在小儿尤文肉瘤的活检标本中发现了TANs。其中两个NETs由TANs活化而来的。这两个病人大剂量化疗后出现转移和早期复发，提示了NETs在尤文肉瘤进展中的作用。 研究也强调了癌症患者中NETs与凝血功能的关系。研究表明，NETs可以诱发肿瘤相关的血栓形成，与肿瘤患者不良预后相关。目前，可以通过NETs标记物（DNA组蛋白复合物，双链DNA，中性粒细胞弹性蛋白酶）评估肝细胞肝癌患者循环NETs水平。同样，可以通过激活系统标记物进行检测。肝细胞肝癌患者循环中NETs和接触系统激活标记物显著高于健康对照组。Jung等人测量了胆管恶性肿瘤患者循环NETs水平和高凝标记物，发现NETs和高凝标记物密切相关。与健康对照组相比，晚期肿瘤患者血浆瓜氨酸组蛋白H3（H3Cit）水平更高，肿瘤患者中性粒细胞H3Cit水平更高。肿瘤患者血浆H3Cit水平与NETosis激活剂：NE、MPO、IL-6和IL-8相关。  NETs被认为是肿瘤治疗中很有前途的潜在新兴靶点（图2）。NETs能够诱导肿瘤细胞的转移，可以通过抑制肿瘤组织中NETs的形成和/或激活来治疗肿瘤。但目前的临床试验尚未发现以NETs作为治疗靶点的最佳方式。作为一种可能的肿瘤治疗方法，Gonzalez-Aparicio等人建议通过结合免疫治疗和药物以干扰中性粒细胞趋化和NETs的形成。目前缺乏一个良好的针对NETs治疗反应的生物标记物。可用于预测NETs形成的标记物是H3Cit和MPO-DNA，对预测肿瘤患者预后有一定价值。有研究提示检测肿瘤活检组织中NETs和G-CSF作为患者靶向治疗效果标准，但这些研究没有得到明确的结论。根据Jorch和Kubes的综述，大多数实验和临床研究都致力于NETs在癌症以外的疾病中的作用，如自身免疫性疾病、肺部疾病和自身免疫性疾病相关并发症。 研究证明，系统性红斑狼疮（SLE）中，血清核酸内切酶是降解NETs染色质的必需酶。在某些系统性红斑狼疮患者中，DNase功能异常会导致严重的肾功能损伤，证明了维持NETs形成和降解平衡的重要性。介于DNA酶可以降解NETs结构，NETs可以作为DNA酶治疗的靶点。根据以上结论，DNA酶已在肿瘤模型中进行了试验。如DNA酶治疗可降低乳腺癌小鼠模型的肿瘤负荷。此外，在模拟肿瘤炎症环境的术后腹腔内脓毒症小鼠模型中，DNA酶可以降低体内NETs捕获和黏附循环肿瘤细胞的作用。研究显示，通过全身给药，DNA酶可减少转移性肺癌小鼠模型的转移灶。使用纳米颗粒包裹DNA酶可以稳定DNA酶链，使循环中的DNA酶更稳定高效。DNA酶纳米颗粒可在体外降解NETs并阻断乳腺癌肺转移灶的生成，但它们不能抑制原发性肿瘤的生长。这些动物模型研究结果，由于没有临床毒性，鼓励了DNA酶在人类癌症治疗中的应用。FDA批准了DNA酶用于治疗囊性纤维化患者，这些患者肺部合成过多的NETs导致支气管中粘液增多。用于非肿瘤患者干扰NETs形成的分子抑制剂也可用于肿瘤患者。用于慢性阻塞性肺部疾病的NE抑制剂和PDA4抑制剂可改善肿瘤患者的临床预后。目前临床使用的PAD4抑制剂Cl-氨基血浆半衰期较短的。 Domingo-Gonzalez等人证明PGE2通过EP2或EP4路径对移植造血干细胞的小鼠和患者的NETs形成产生负性调节作用。该研究揭示了另一种抑制NETs形成的方法。另一项研究发现，PGE1能通过诱导细胞内cAMP和减少细胞内钙离子抑制肿瘤细胞和PMA诱导的NETs形成。抗凝血酶可显著减少由癌细胞诱导的NETs的形成。此外，NET抑制剂氯喹可降低负瘤小鼠的血小板聚集，循环组织因子含量，以及缓解高凝状态。该方法在病人身上也同样有效。Hector Salazar-Gonzalez等人在其综述中讨论了NETs在肾脏疾病中的作用，强调了阻断NETs的形成可以干扰包括炎症性、非炎症性以及肿瘤的发病机制。NETs作为肿瘤治疗的潜在靶点已不再是假说，NETs可作为直接治疗靶点用于膀胱癌治疗中。在免疫治疗早期阶段由卡介苗（BCG）诱导的NETs有免疫调节作用，可以通过募集T细胞和单核巨噬细胞预防肿瘤增长。此外，BCG诱导的NETs可诱导细胞凋亡和暂停细胞周期，从而抑制肿瘤细胞迁移。 “论肿道麻”述评  “论肿道麻”系列回顾： 点击标题，温故知新 253.Nature Metabolism综述：T细胞耗竭的代谢和表观遗传学调控 252.Cancer Research:血小板TLR4-ERK5轴促进手术应激后NET介导的循环肿瘤细胞捕获和远处转移 251.Cell Metabolism: NAD 代谢之概念演进 250.Nature Review: 铁死亡在疾病中的发病机制、生物学及作用 246.Cancer Discovery综述:肿瘤微环境中的代谢相互依赖 245.体内稳态和肿瘤免疫中的T细胞代谢 244.靶向代谢治疗，推动免疫治疗革命 233.Nature Reviews Cancer综述：肿瘤的系统性免疫 231.肿瘤中固有免疫细胞的代谢 229.手术相关转移的神经免疫调节 228.围术期红细胞输注与胃肠道癌症手术患者全因死亡率和癌症特异性死亡率的相关性研究：一项人群队列研究的长期随访结果 225.Cell重磅综述：健康的标志 223.肠道菌群对接受免疫治疗癌症患者的作用：饮食和药物治疗的影响 222..乳酸在炎症和肿瘤微环境中的免疫调节作用 220.静脉或吸入麻醉（伴或不伴静脉利多卡因）对乳腺癌术后中性粒细胞胞外诱捕和血管生成生物标志物的影响：一项前瞻性随机试验 219.肌动蛋白调节剂hMENA调节GAS6-AXL轴和促肿瘤癌细胞/基质细胞合作 218.普瑞巴林联合吗啡治疗胰腺癌疼痛的镇痛效果，一项回顾性研究 217.全身麻醉和镇静下行内镜逆行胰胆管造影（ERCP）术后结局的比较 216.原发性乳腺癌患者的麻醉和循环肿瘤细胞：一项随机对照研究 214.音乐与咪达唑仑在缓解术前神经阻滞过程中焦虑的效果比较：一项前瞻性随机对照研究 213.麻黄碱与去氧肾上腺素对麻醉中脑肿瘤患者脑血流和耗氧量的影响——一项随机临床试验 212.美沙酮与吗啡用于妇科肿瘤手术患者术后镇痛的比较:一项随机对照临床研究 211.术中阿片类药物与改善三阴性乳腺癌无疾病复发存活期有关 210.肿瘤细胞转移期间的代谢特征 209.七氟烷麻醉对体内结合单胺氧化酶-B的放射性配体的影响 208.罗哌卡因腹腔注射可缩短晚期卵巢癌术后开始化疗的时间间隔：一项随机对照双盲试点研究 207.地塞米松用量与乳腺癌切除术后早期康复：一项随机双盲试验 206.吸入麻醉与全凭静脉麻醉对消化道肿瘤手术患者预后的影响 205.术后阿片类药物的持续使用 203.人类肿瘤图谱网络:以单细胞分辨率描绘肿瘤的跨时空转变 202.区域麻醉和急性疼痛管理的进展 |
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