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科学技術振興機構（ＪＳＴ） 東京大学 开发在细胞外复制和进化的人工基因组DNA ~期待构筑自主增殖进化的人工细胞~ 重点 生物可以利用写在基因组DNA上的信息复制DNA进行进化，但具有这种能力的人造物体至今还没有被制造出来。 本研究通过利用人工基因组DNA和无细胞转录翻译系统，世界上首次成功地进化出了在细胞外表达基因的同时进行复制的DNA。 通过向该人工基因组DNA中添加基因，将来可以构建能够自主增殖的人工细胞，有望为高效的有用物质生产做出贡献。 在JST战略性创造研究推进事业中，东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业附属先进科学研究机构/生物普遍性联合研究机构的市桥伯一教授等人仅使用核酸和蛋白质等非生物材料，在细胞外首次成功地进行了来自生物特征DNA的基因表达和持续复制的进化。增加和进化是生物的一大特征，但具有这种特征的人造物体至今还没有被制造出来。 本研究小组通过使用含有DNA复制所需的2个基因的环状DNA (人工基因组DNA )和无细胞转录翻译系注1 )，成功地将基因翻译成蛋白质，通过其翻译的蛋白质复制了原来的环状DNA。 并且通过将这个DNA复制周期持续约60天，成功进化成了复制效率上升了约10倍的DNA。 如果在这次开发的人工基因组DNA中追加转录翻译所需的基因，将来只要提供氨基酸和碱基等低分子化合物，就可以发展成自主增殖的人工细胞。 如果产生了那样的人工细胞，我们就可以期待现在进行的医药品开发和食品生产等使用生物的有用物质生产会变得更加稳定和容易控制。 本研究成果于2021年11月16日(美国东部时间)在美国科学杂志《ACS SyntheticBiology》的在线版上公布。 本成果通过以下事业研究领域研究课题获得。 战略性创造研究推进事业团队型研究( CREST ) 研究领域:“通过基因组尺度的DNA设计·合成创造细胞控制技术” (研究总结:盐见春彦庆应义塾大学医学部教授) 研究课题名称:“开发自我再生产和进化的人工基因组复制转录翻译系统” 研究代表人:市桥伯一(东京大学研究生院综合文化研究科教授) 研究期间:令和2年11月~令和8年3月 在这个领域，JST的目标是阐明基因组的工作原理和创造细胞利用的基础技术。 上述研究课题的目标是开发一边自我再生产一边复制进化的人工基因组DNA。 <研究背景和经过> 增加和进化是生物的一大特征。 由于生物具有增加的能力，可以用于食物和医药品等廉价的生产。 因为可以进一步进化，所以也可以改良品种。 但是，由于生物不能适合人类，所以使用生物制作的控制性和稳定性有限。 如果能够制造出增加并具有进化能力的人工分子系统的话，就可以期待能够更加高效稳定地进行至今为止依赖于生物的有用物质生产。 对生物“不断增加进化的能力”来说，最重要的条件是要长期持续复制生物设计图即基因组DNA。 在这个复制过程中，基因组DNA发生变异，如果该变异有利于子孙的数量和生存，那么该变异就会通过在群体中传播而发生进化。 因此，为了开发不断增加进化的人工分子系统，首先需要长时间持续进行DNA的复制。 要像生物一样进一步进化，并不只是复制DNA就可以了，需要翻译写在DNA上的信息(基因)使蛋白质表达，根据其蛋白质复制DNA。 迄今为止，还没有实现这种DNA复制所需的基因的表达和由此产生的DNA复制同时发生的反应体系构建。 造成这种情况的一大障碍是，DNA复制所需的基因很多(大肠杆菌型的DNA复制约20种，病毒型需要4种)，而且其中一部分需要高浓度的蛋白质，所以现在的无细胞转录翻译系统很难以充分提供所有的基因。 <研究内容> 因此，本研究小组决定人工制作出用更少的基因、低浓度的蛋白质就能达成的DNA复制结构，而不是像生物使用的那样精巧但需要大量基因的复杂的DNA复制结构。 在这次使用的DNA复制机制中，只需要2种基因( Phi29 DNA复制酶注2 )和Cre重组酶注3 ) )就可以复制环状DNA (称为人工基因组DNA ) (图1 )。 首先，Phi29 DNA复制酶一边从环状DNA中的不特定位置剥离双链DNA，一边合成互补DNA。 虽然作为模板的DNA呈环状，但由于自身合成的DNA链会被剥离，进一步继续合成，最终将形成长达数十公里的碱基对的长直链状单链DNA。 另外，DNA复制酶合成互补链，形成长双链DNA后，Cre重组酶发生作用，对被称为loxP的34碱基对的DNA序列之间发生同源重组。 因为原来的环状DNA中含有1个loxP序列，所以其间如果发生同源重组，环状DNA就会再生。 以上的DNA复制机制只需要两个基因就可以进行递归环状DNA的复制。 另外，预计这两种蛋白质在低浓度下也可以充分发挥作用，在现在的无细胞翻译系统中可以充分表达量。 本研究首先验证了该人工基因组DNA是否可以持续复制。 用无细胞转录翻译系统对人工基因组DNA进行了图1所示的反应。 于是，DNA被复制了1000倍以上(图2，第1回合)。 为了确认DNA的持续复制，取出一部分反应液用新的无细胞转录翻译液稀释，同样尝试进行下一轮的转录翻译复制，结果DNA增加了2倍左右(图2、第2回合)。 照这个样子反复稀释和反应多次传代，DNA的增加就会慢慢恶化，8次传代后DNA完全不增加了。 其理由是在复制中会发生因复制错误而破坏基因功能的变异，如果反复复制，总有一天基因会损坏。 问题是，拥有这些坏基因的DNA也会继续被其他从正常基因中表达的蛋白质复制，最终正常基因消失，整体上停止复制(图3左)。除去具有这种坏基因的DNA的方法之一是，像细胞一样导入分区结构，将每个细胞的基因组DNA数量限定为少数(如果可能的话为1个)。 这样一来，带有坏基因的DNA由于无法制造正常的蛋白质而无法复制，不久应该就会被稀释(图3右)。 作为这样的分区结构，使用了直径0.5~0.8微米( m )的油中水滴。油中水滴可以通过在矿物油中加入表面活性剂和反应溶液，剧烈搅拌来制作。 在这样制作的水滴中封入人工基因组DNA和无细胞转录翻译反应液，在30度下进行16小时的图1所示的DNA复制反应。 然后，如图4A所示用含有新的无细胞转录翻译系统的水滴稀释，进行下一轮的反应。 在这样的分区结构中进行传代反应后，与之前的结果不同，经过8个回合后复制仍持续(图4B )。 而且当初DNA浓度有逐渐下降的趋势，但到了18回合后突然变得经常增加，能够持续进行DNA复制到60回合( 60天，相当于140代)。 在30个回合的时候，分离出18个DNA，对其序列进行调查，平均有7个变异，其中5个是过半数的DNA共有的。 另外，分离出的多数DNA的复制能力与原来的DNA相比最大上升到了约10倍(图5 )。 这表明发生了适应性进化。 这里重要的是，在这个实验中，研究者并不是有意选择了复制量特别高的DNA。 研究人员进行的只是每天调整、稀释水滴，用30度加热。 作为操作，与传代培养微生物没有太大差别。 核酸和蛋白质等无生物分子的集合只是“培养”，DNA就开始自由进化，这一点具有本研究的新颖性。 另一个有趣的现象是，DNA浓度的推移以剧烈波动的方式反复上升和下降(图4B、20回合和50回合左右达到极大)。 我认为这种现象可能是因为出现了寄生型的DNA。 实际上，研究了DNA浓度每20个回合增加的DNA，发现除了原来的人工基因组DNA以外，由缺失了DNA复制酶和重组酶两种基因的100个碱基长度左右的重复结构构成的DNA过度扩增。 由于这个DNA不具备DNA复制所需的基因，所以不能单独增加，但如果在同一区域内存在正常的DNA，就可以寄生于它而增加。 同样的寄生型复制体的出现和振动的浓度推移，在本研究的作者们进行的RNA进化实验注4 )中也被观察到( Furubayashi et al eLIFE 2020 )，可以认为同样的现象在DNA的情况下也发生了。 寄生型复制体无论是RNA还是DNA都很快出现了，这暗示着寄生种的出现对基因组复制系统来说是普遍的现象。 <今后的展开> 虽然现在的人工基因组DNA中只搭载了DNA复制所需的2个基因，但可以通过导入其他基因来扩展人工基因组DNA所具有的功能。 例如，由于现在放在无细胞翻译系统中的RNA和蛋白质也能从基因组DNA中表达，今后，如果载有转录翻译所需的所有基因，只需提供氨基酸和碱基等低分子化合物，就可以发展成自主增殖的人工分子系统 。导入膜合成基因的话，有可能产生细胞膜。 另外，如果翻译的蛋白质功能不充分，也可以通过进化来提高其功能。 如果以本研究开发的人工基因组DNA为核心，则可以期待构建出自主增殖的人工细胞。 可以认为，如果形成这种自主增殖的人工分子系统，现在依赖生物的医药品开发和食品生产等就可以被这种系统取代。 生物虽然结实稳定，但是不能方便人类。 另外，生物的工作原理中还留有很多黑匣子。 因此，使用生物制造总是有限制。 另一方面，如果是人工构筑的分子系统，则只包含必要的要素，全部可以用已知的物质制作，所以设计和控制变得容易。 将来，通过使用这样的人工系统，期待能够更稳定地控制目前使用生物的有用物质的生产。 ＜参考图＞
图1人工设计的DNA复制的结构 由DNA表达2种蛋白质，通过Phi29 DNA复制酶由环状DNA合成双链长的直链状DNA。 之后，Cre重组酶在分子内发生同源重组，使环状DNA再生。 这时产生的环状DNA的大小本来就有可能大两倍、三倍。 另外，也存在不变成环状DNA，直接复制长直链状DNA的路径。 这种DNA复制的结构曾于2006年由海外小组提出，但由于Cre重组酶强烈阻碍DNA复制酶的功能，多年来一直未能实现( Forster et al 2006 Mol Sys Biol )。 在本研究组的前期研究中，获得了抑制效果小的DNA复制酶突变体( Sakatani et al 2018 Sci Rep )，使本研究成为可能。
图2在无分区结构的条件下传代时的DNA浓度推移 由DNA表达2种蛋白质，通过Phi29 DNA复制酶由环状DNA合成双链长的直链状DNA。 之后，Cre重组酶在分子内发生同源重组，使环状DNA再生。 这时产生的环状DNA的大小本来就有可能大两倍、三倍。 另外，也存在不变成环状DNA，直接复制长直链状DNA的路径。 这种DNA复制的结构曾于2006年由海外小组提出，但由于Cre重组酶强烈阻碍DNA复制酶的功能，多年来一直未能实现( Forster et al 2006 Mol Sys Biol )。 在本研究组的前期研究中，获得了抑制效果小的DNA复制酶突变体( Sakatani et al 2018 Sci Rep )，使本研究成为可能。
图3类似细胞分区结构的效果 左)没有分区结构的时候，即使基因被破坏了的DNA也会和其他正常的DNA一样被复制，所以无法被除去。 右)如果有分区结构，每个分区的DNA为1分子的话，基因破坏了的DNA不会被复制，所以不久就会变得不被稀释，从而被除去。
图4在有地块结构的条件下传代时的DNA浓度推移。 a )在油中水滴中进行如图1所示的反应，在下一个回合中，用含有新的无细胞转录翻译反应液的油中水滴稀释，通过搅拌，使水滴内部发生混合反应。 b )在各回合中测量了DNA浓度。 独立有两个系列的实验，上面给出了其中的一个例子。 两者的复制都持续到了最后。 在黑箭头所示的回合中，由于DNA浓度在检测灵敏度以下，因此一度取出DNA并人为放大后，再次返回到区内。
图5分离的DNA复制能力的比较 对在回合30中分离出的多个DNA进行了图1所示的转录·翻译·复制反应，比较了含有环状、线性DNA的总DNA复制量。 <用语解说> 注1 )无细胞转录翻译系统 含有从细胞外编码为DNA的基因转录RNA，翻译成蛋白质所需的所有因子的反应液。 本研究特别是由清水义宏(现理化研究所生命功能科学研究中心无细胞蛋白质合成研究小组组长)等在东京大学上田卓也研究室开发的，全部由纯化的已知蛋白质和RNA构成的重构型物质( PURE SYSTEM，Shimizu ) 注2 ) Phi29 DNA复制酶 枯草杆菌噬菌体phi29携带的DNA复制酶。 该酶可以以DNA和RNA为引物合成DNA链。 由于具有链置换活性，可以在分离双链的同时继续进行DNA合成。 预计在本研究中，将通过转录酶制作的RNA片段作为引物进行复制。 注3 ) Cre重组酶 大肠杆菌噬菌体P1携带的DNA重组酶。 可以重组被称为loxP的34碱基长度的序列。 本研究中使用的人工基因组DNA有一个loxP。 注4 ) RNA的进化实验 本研究开发的这种持续复制进化的系统，过去由本集团的成员用RNA而不是DNA达成( Ichihashi et al.Nat Commun 2013 )。 但是，RNA基因组的情况下，可持续复制的RNA的长度有限，难以添加基因，缺乏发展性。 与此相对，此次开发的DNA基因组目前没有那样的限制，可以追加多个基因，期待着各种各样的应用。 <论文标题> “连续小区自由复制和发展体系通用DNA in a “比较通用表达式系统” (人工基因组DNA在分区无细胞基因表达系统中的持续复制和 进化) DOI:10.1021/acssynbio.1c00430 <咨询方式> <有关研究的事情> 市桥伯一 东京大学研究生院综合文化研究科教授 9 〒153-8505东京都目黑区驹场4-6-1 T栋303 电子邮件: ichi Hashi bio.c.u-Tokyo.AC.JP <关于JST事业的事情> 保田睦子 科技振兴机构战略研究推进部生命创新小组 〒102-0076东京都千代田区五番町7 k’s五番町 03-3512-3524传真: 03-3222-2064 电子邮件: crest jst.go.jp <新闻负责人> 科学技术振兴机构宣传科 邮编〒102-8666东京都千代田区四番町5番地3 03-5214-8404传真: 03-5214-8432 电子邮件:日本航空 东京大学教养学部等总务科宣传信息企划小组 〒153-8902东京都目黑区驹场3-8-1 03-5454-6306 电子邮件: Koho-j Yoho.c GS.mail.u- |
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