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从传统的RT-qPCR会发现，每个样本都要做一个内参基因，如上面提到的哺乳动物会选择GAPDH，而miRNA则会选择U6。那么我们的m6A-IP–qPCR 是不是也需要内参基因，根据我们查阅的大量文献来看，绝大部分是没有的，少量文献也会使用到内参基因或者我们称之为negative control gene。 那么是不是m6A-IP–qPCR 就真的没内参了呢？其实也不是！实际上我们会发现整个input充当了内参基因的概念，一个基因的甲基化水平是无法直接用RIP下来的RNA在做qPCR后直接用Ct值高低来衡量的，需要input中的RNA作为背景。而IgG抗体的加入则是为了排除m6A抗体非特异性结合情况发生。由于有时候m6A抗体不同厂家、保质期、蛋白性能等因素可能会产生非特异性结合的结果，这时候就需要用IgG来排除这部分的干扰。目前市面上使用的绝大部分m6A抗体为兔抗，那么尽量在使用IgG做对照时也使用兔抗来源的IgG。 那么我们首先依旧是与传统的RT-qPCR相似，用相应的软件实时监测扩增曲线。溶解曲线必须是单峰，以保证引物特异性扩增。然后就是校准每一个样本的平均Ct值，以消除样本准备过程中的差异。 接下来我们就要开始对每个样本中，RIP和input的3个技术重复得到的Ct值计算平均值，再对3个生物学重复样本中的Ct平均值再去计算其Ct平均值，得到Average Ct RIP和Average Ct input。最后计算稀释系数，即input dilution factor，也就是input的RNA占m6A-IP的RNA有多少比例。根据上面的示例，也就是input RNA=100ng而m6A-IP RNA=1ug，那此处的稀释系数=10%。最后根据这些数值，我们可以计算出归一化后的ΔCt值，也叫ΔCt normalized RIP。 这里为什么归一化后的ΔCt normalized RIP还要减去log2（input dilution factor）呢？那是因为需要减去input的噪音，排除其干扰。由于RNA样本特别稀少，所以在做实验的时候往往会把input的使用量按照一定比例减少。如本文中input的占比就只有10%，那么稀释倍数（Input Dilution Factor）就是0.1。最极端的情况，就是RNA十分的富余，所以当input的比例理论上和m6A-IP及IgG-IP的比例一样时，那么log2（input dilution factor）=0，也就无需相减了。所以加入稀释系数的校正，目的就是为了达到input：m6A-IP：IgG-IP=1：1：1的效果。 下一步就是要计算在RIP下来的RNA中某一个基因占input中这个基因有多少的百分比。换句话说就是有input中的某个基因究竟有百分之多少发生了甲基化，所以这里我们用%input来表示。基本上到这一步，部分老师不想做IgG验证的，会把这个数据直接放在论文里，但是我们建议还是要加入IgG的部分。当然这一步需要进行线性归一化处理，方法与上面的RT-qPCR 类似，其公式为： %input = 2（-ΔCt normalized RIP） 由于无法判断m6A抗体是否存在非特异性富集的情况，所以要过滤这些噪音还需要使用兔抗IgG再对RNA进行一次富集。这时候就需要对ΔCt再次进行背景去除。其中需要检测的目的基因在IgG中的ΔCt值就是ΔCt negative control。其公式为：
最后一步就是最激动人心的一刻，那就是计算甲基化富集倍数，也叫Fold Enrichment，其公式为：
那么不加IgG可以直接将结果用于论文中的数据呈现吗？其实在部分的高分文章中我们也发现不用IgG直接进行验证的，即用%input数据直接用于表示甲基化比例。但是为了保险起见，我们还是强烈推荐老师加入IgG组的数据用于后期校正。 |
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