感兴趣的伙伴们,可回顾前贴《NGS文库质量之“兵器谱”》 其中有一款仪器Agilent2100,若以兵器谱比之,当为七种武器之“碧玉刀” -精准可量化。结果华美可靠! Agilent2100及其类似产品 原理:毛细管电泳 检测目的:文库不同长度的分子片段的分布情况是否合适。如小片段过多,或文库长度过长皆会影响后续测序实验。 优点:精准;结果可量化;可形成图表报告。 缺点:需购买配套的芯片和胶。小贵! 总结:凝胶电泳的土豪版。追求质量的选用 为方便同好掌握,特分享agilent2100 SOP操作手册 Agilent 2100 操作SOP 1实验目的:微电泳系统,通过检测荧光度,对核酸进行分析 2 使用范围:构建好的文库 3 实验步骤: 3.1芯片制备器的准备: 3.1.1 芯片槽的设定:将芯片的槽固定在位置C(实验为DNA,若是RNA或者蛋白则有其他位置,本实验全部固定于C,请勿移动位置) 3.1.2 注胶器档位设定:将位置固定于最下端的档位(实验为DNA,若是RNA或者蛋白则有其他位置,本实验全部固定于最下档,请勿移动位置) 3.1.3 注射器的位置:固定在1ml处,勿动!!(注:正式使用前需检查密闭性,即用注射器瞬间压下后放开,观察其自动升起的高度,如达到6以上则为合格,6以下说明有漏气需重新放置或拧紧注射器) 3.1.4 芯片混匀仪的设定:调制最大转速,勿动!(其自动设定为1min,制备芯片完毕后,放于槽内,其会在1min时自动停止) 3.2 试剂制备 3.2.1 将试剂盒从冷藏室内取出,避光放于室温环境下,至少30min。(试剂必须放置在室温30min平衡,否则会影响后续的实验,对结果产生严重影响) 3.2.2 试剂混合:从试剂盒中取出High Sensitivity DNA dye concentrate(上盖是蓝色的),将其涡旋混匀10 S,使其中的DMSO充分混匀。稍微离心使液体进入管底。 3.2.3 取15 μl High Sensitivity DNA dye concentrate(上盖是蓝色的)加入到High Sensitivity DNA gel Matrix vial(上盖是红色的),稍微涡旋混匀。 3.2.4 将3中混合好的液体加入到过滤柱中。 3.2.5 将4中柱子放置于室温离心机中,2240g离心10min。 3.2.6 将离心柱丢弃,保存离心后的试剂(务必要避光,记录首次混匀的时间,试剂在混合后务必不要超过六周,每次混匀的试剂可以用于5张芯片)。 3.2.7 将试剂保存于4℃冰箱内,避光保存,每次使用前需要将其放于室温30min平衡。务必保持避光。 3.3 芯片制备 3.3.1 将胶混合液及试剂盒内试剂室温平衡30min后进行操作。 3.3.2 取出新的芯片,将芯片固定于芯片槽内,在注胶位置上,加入9μl(注每次加样务必加在管底,不能加在管壁上,且每次加样时将移液器打到第一档即可,防止产生气泡)。 3.3.3 设定计时器60s倒计时,将注胶器上的注射器位置放于1ml处,盖上注胶器(盖严时会听到“当“的一声),将注射器缓慢推下,固定在最低档后开始倒计时60s。 3.3.4 倒计时完成后,从档位处小心取下注射器,默数5s后,缓慢的将注射器上提,至1ml处时停止。 3.3.5 打开芯片制备器,在加胶孔各加入9μl混合胶。 3.3.6 加入Marker,在所有的12个孔(11个样本槽和1个ladder孔)中加入5ul Marker(绿色的盖)。 3.3.7 加入ladder,在Ladder孔中加入1μl Ladder(黄色的盖子)。 3.3.8 加入样本(样本的浓度范围为5-500pg/μl)在样本孔中加入1μl样本,如果样本不足11个,在没有样本的孔中加入1μl 超纯水代替。(注:此步浓度笔者一般采用ng级别) 3.3.9 将制备好的芯片置于芯片混匀仪中,在最大转速下,按下Start,1min后自动完成,在5min内将芯片进行测定。 3.3 芯片检测 3.4.1 打开2100检测仪,点击软件打开页面。 3.4.2 将芯片放于芯片槽内,固定好后,关上机盖。 3.4.3 选择测定程序:选择接头(电脑与2100的嫁接默认为1,如果脱机运行选择demo),电脑与2100连接后会显示online, 选择测试类型(点击analysis,选择High Sensitivity DNA)。 3.4.5 样本详细信息的输入,在芯片位置处进行双击后进行输入。 3.4.6 点击Start开始运行。大约10min后开始出现Ladder,如果15条ladder正常,则运行基本正常。在45min后仪器运行结束,注意仪器运行过程中,请勿操作界面,更不要震动台面。 3.4.7 机器的清洗:仪器运行结束后,将空白的清洗芯片每孔加入9μl超纯水,换下运行结束的芯片,盖上机盖,半小时后取出。 3.4.8 关闭机器,关闭页面,关闭电脑,运行结束。 |
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