【原】细胞侵袭实验详细步骤

1. 复苏代数靠前的肿瘤细胞，在含有10% FBS的培养基中预先培养2-3代，待细胞汇合达到80%左右，饥饿处理18-24小时。

2.  准备铺胶：

a） 4 °C溶matirgel胶过夜

b）将细胞小室、培养板和枪头等于4°C 预冷

c）用无血清的冷培养基稀释matirgel胶至一定浓度，加入到细胞小室的上层（按照产品说明书的推荐比例和体积），轻轻摇晃使胶均匀铺在膜上。以上操作在冰上进行

d）立即将铺好matrigel胶的细胞小室置于培养板中，于37 ° C孵育1小时左右，matirgel胶可由液体凝成固体，吸走多余的或者未凝的胶

3. 细胞用PBS清洗一次，胰酶消化，然后用包含5% BSA的无血清培养基中和，1500rpm离心5-10min。

4. 用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度

5. 取上述细胞液加入小室，下室（培养板）加入含有10% FBS的培养基。不同规格的小室和培养板所加的体积不同，具体参考产品说明书

6. 37 °C孵育24至72小时，依据肿瘤细胞类型而定

7. 孵育结束，小心取出细胞小室，吸掉小室上层培养液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%结晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色20min，然后进行第8步或者第9步。

8. PBS清洗两次以去除多余的染料，立即用棉签擦去滤膜上层的细胞，自然静置风干。显微镜下观察滤膜下层的细胞，随机选取不同的视野计数并算平均值。

9. 结晶紫溶解滤膜下层细胞，然后用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm读取OD值。这种方法可以避免视野下细胞穿透不均匀带来的误差。