大家好，感谢大家多年以来的陪伴。在此，小编祝大家新年快乐，虎年大吉。今天为大家总结一下2021年期间王初课题组公众号推送的翻译后修饰相关的文献。本文侧重于翻译后修饰相关新化学生物学工具的开发，修饰功能相关的研究列于文章末尾，供感兴趣的读者查阅。蛋白质是生命活动的主要执行者，蛋白质能否正常发挥其生理功能受着众多因素的调控，其中蛋白上的翻译后修饰(PTMs)起着至关重要的作用。为了对种类丰富、形式多样的翻译后修饰进行研究，人们开发了一系列化学生物学工具用于翻译后修饰的组学鉴定、机制表征以及后续的功能研究。
在组学水平上研究翻译后修饰的化学生物学策略一般包括利用化学探针对PTM进行直接捕获，利用生物正交类似物对PTM进行标记，以及通过氨基酸位点选择性的探针进行竞争性标记，还有通过特异性抗体进行富集等，同时算法和质谱技术的进步，时空分辨率的引入也为翻译后修饰研究的进步起到了推动作用。- 翻译后修饰的直接捕获(S-次磺酰化，天冬氨酸磷酸化，O-GlcNAc)
如果待研究的翻译后修饰结构中存在具有化学反应性的官能团，那么就可以利用这种反应活性设计探针，进而将带有修饰的蛋白/肽段从复杂的蛋白质组中被富集出来。三苯基磷酰亚胺是一种Wittig试剂，它常被用于化学合成中，它具有高度极化的P-C键，所以负碳离子具有很强的亲核性。其中通过吸电子效应或者共振稳定作用，阴离子稳定基团（ASG）可以进一步调节α碳产生稳定的ylides，甚至可以在水相中稳定存在。在【Nat. Chem. | 利用Witting试剂实现对蛋白质次磺酰化修饰的全面标记和分析】一文中，作者基于wittig试剂开发了能够选择性捕获次磺酰化修饰的探针WYne，相比于此前报道的探针具有高度的选择性和生物相容性。文中不仅对全蛋白质组中的次磺酰化蛋白进行了整体性的分析，还对次磺酰化的修饰率进行了研究，发现大部分蛋白的次磺酰化修饰率低于30%，并且同一蛋白上的不同半胱氨酸发生次磺酰化修饰的差距非常大。
肼探针是此前已被报道用于捕获蛋白上亲电性的醛基修饰的探针，在【Chem. Sci. | 利用羟胺探针揭示CprR在铜绿假单胞菌中的应激调节作用】一文中，作者发现羟胺探针在微酸性的条件下可以与天冬氨酸残基上的磷酸化(pAsp)修饰反应，并产生稳定的N-羟基-天冬酰胺衍生物，进而利用这一反应实现了对枯草杆菌和铜绿假单胞杆菌中的pAsp修饰的大规模检测。后续作者利用定量化学蛋白质组学策略对铜绿假单胞菌在强啡肽A刺激条件下pAsp的变化进行定量分析，发现阳离子态肽反应调节分子CprR的D53上磷酸化升高最明显。CprS和CprR组成的系统属于双组分系统，目前研究发现用于感知抗生素激活脂多糖的产生，带负电的脂多糖可以结合带正电的阿拉伯糖胺从而能够减少阳离子结合，表达适应性的抵抗，本篇文章的研究发现了CprRS在铜绿假单胞菌中的新作用。
对于由一些细胞内代谢物引起的翻译后修饰，一种常见的策略是对代谢物分子进行衍生从而引入生物正交基团，进而能够通过后续的click反应连接富集基团，实现对修饰蛋白的富集与鉴定。在【号外 | 王初课题组发展沙门氏菌中的衣康酸修饰组学鉴定新方法】一文中作者开发了衣康酸的生物正交类似物C3A，发现其相比长链的酯探针Italk在沙门氏菌中有更好的标记效果，并利用C3A探针实现了病原菌中衣康酸修饰的大规模鉴定。不仅在沙门氏菌中提供了一个丰富的衣康酸修饰蛋白的数据库，还揭示了衣康酸通过共价修饰从而抑菌的新机制，这对于进一步理解衣康酸的抗菌功能有着重要意义。
色氨酸的C -甘露糖基化是蛋白上的一种特殊的共翻译修饰，是迄今为止报道的唯一一例蛋白上的C糖基化。基于特征基序等信息进行生信分析，人类有超过500个潜在的色氨酸C -甘露糖基化的蛋白，但由于检测方式和策略的局限，目前所知甚少。【Nat. Chem. Biol. | “酵母过表达体系 抗体制备”助力色氨酸C -甘露糖基化的拓展研究】中作者基于酵母过表达体系高表达这一修饰的修饰酶DPY19，对C -甘露糖基化的功能和修饰位点进行了探究，并得到了对这一修饰特异性的抗体，实现了小鼠大脑的色氨酸C-甘露糖基化组的初步绘制。
- 翻译后修饰相关的算法和质谱技术进展(糖基化，瓜氨酸化，泛素化，磷酸化)
在蛋白质糖基化组学研究中，目前常见的搜索糖肽的引擎主要先解析肽段的序列，并将糖视为一个可变修饰，糖层面的解析质量不是一个关键。但例如pGlyco的算法则先确定糖的部分，在移除不可靠的糖链后解析肽段部分。【Nat. Methods | pGlyco3实现准确快速的糖肽及修饰位点分析】一文中作者在此基础上开发了pGlyco3，结合ETxxD的信息可位点特异地识别糖修饰位点，并支持带修饰的糖链的解析。在利用质谱鉴定瓜氨酸化位点时，但由于瓜氨酸化只导致大约 0.984 Da的很小质量改变，再加上蛋白质组中瓜氨酸肽的丰度低，当前的数据库搜索算法通常会错误注释谱图，导致大量假阳性结果出现。【Biochemistry | 瓜氨酸化位点的快速鉴定】一文作者报告了两种新开发的算法，ionFinder 和 envoMatch，能以较高的可信度和高效的实验流程检测瓜氨酸位点。
传统的翻译后修饰研究方法主要集中在全细胞水平的分析，发展翻译后修饰在亚细胞水平的分布和动态变化的研究方法是很必要的。在【PNAS | 具有时空分辨率的亚细胞磷酸化组学新技术-SubMAPP】一文中作者开发了subcellular-specific uncaging-assisted bioti nylation and mapping of phosphoproteome（SubMapp)技术，利用非天然氨基酸技术cage后的TurboID富集时空特异的蛋白质组，再经过IMAC富集磷酸化肽，实现了亚细胞磷酸化修饰动态变化的分析。
前面提到的组学水平上的鉴定手段为研究者们提供了大量潜在的功能性修饰位点，但这些翻译后修饰如何由细胞内产生，产生之后又发挥着什么样的功能则还需要更深入的研究。由于蛋白翻译后修饰种类丰富、形式复杂，因此若想单独研究特定位点上某种翻译后修饰的功能，首先是要获得特定位点带有这种修饰的蛋白，此前被证明可行的方法包括非天然氨基酸插入，以及体外的蛋白化学合成等。另一方面，寻找翻译后修饰在细胞内的结合蛋白对于发现其writer, eraser尤其是reader，进而深入了解其调控机制有着重要的意义。- 非天然氨基酸插入技术引入翻译后修饰(赖氨酸苯甲酰化)
非天然氨基酸插入技术的优势在于能够在活细胞的体系内表达出特定位点带有修饰的蛋白，对于研究生理环境下修饰的功能具有重要意义，但由于非天然氨基酸的插入依赖于氨酰tRNA合成酶对底物的识别，因此对于每一个翻译后修饰都需要通过突变等手段找到特定的酶，一定程度上限制了其普适性。以组蛋白上丰富的酰基化修饰为例，非天然氨基酸插入技术此前已经成功实现了组蛋白上乙酰化、巴豆酰化、丁酰化等线性短链酰基化的插入，在去年推送的【ACS Chem. Bio. | 苯甲酰赖氨酸作为多功能探针用于研究活细胞中的组蛋白苯甲酰化】一文中，作者结合理论模拟与突变实验，成功找到了能够插入带有疏水性芳环的苯甲酰化修饰的PylRS突变体，能够位点特异性的在天然全长组蛋白中进行赖氨酸苯甲酰化，以研究苯甲酰化和苯甲酰化-结合伴侣在体外和生命体系中的相互作用。除此之外他们找到的突变体还可允许氟化苯甲酰赖氨酸的插入，从而结合19F NMR技术可以更好地了解体外组蛋白PTM和体内动力学，为苯甲酰化修饰的功能研究提供了重要的工具。
- 修饰蛋白的体外合成(糖基化，ADP-核糖基化，赖氨酸酰基化，半胱氨酸过硫化，tau蛋白磷酸化、二甲基化)
体外的蛋白化学合成能够得到结构和形式更为复杂的修饰蛋白，尤其对于复杂的糖基化、磷酸化等修饰，对于体外研究不同修饰形式下蛋白的功能变化有着重要帮助。【J. Am. Chem. Soc. | 双功能硫代羧酸介导的糖蛋白半合成】中作者为了提高糖蛋白体外合成的效率，开发了一种基于双硫代羧酸的糖蛋白合成策略，能够通过两步反应高效稳定的合成糖基修饰在天冬氨酸位点的糖蛋白。
在【Angew. Chem. Int. Ed. | 可见光催化的赖氨酸PTM定点插入方法】一文中，作者开发了一种可见光脱硫的C(sp3) -C (sp3)键形成反应，使Nɛ修饰侧链有选择地被安装到感兴趣的肽和蛋白质上，该方法具有快速、操作简单、耐环境大气的优点。作者利用该方法在模型肽上展示了一系列赖氨酸(Lys) PTMs的安装，包括甲基化、多甲基化和酰基化等，并通过在重组表达的泛素(Ub)中有选择地安装NɛAc侧链，展示了该技术的潜力。
随着翻译后修饰领域研究的深入，翻译后修饰家族也在逐渐被壮大，一些全新的翻译后修饰机制逐渐被人们发现，此外，经典的蛋白翻译后修饰还被发现存在于其它生物大分子上。泛素化修饰是真核生物中广泛存在的一种蛋白质上的翻译后修饰，它调控着底物的降解过程。而在【Nature | 细菌表面脂多糖泛素化修饰分析】一文中，作者发现入侵到细胞质中的沙门氏菌表面具有大量泛素修饰，后续研究证实这些泛素化修饰在脂多糖上。脂多糖的泛素化触发了宿主细胞自主免疫，促进了对沙门氏菌的抑制。并且作者还推测脂多糖以外的非蛋白物质也可能引起细胞免疫反应。
在过去，除了少数基于单糖的tRNA修饰，迄今为止没有证据表明RNA和聚糖在自然界中有直接联系。人们通常也不会认为RNA是糖基化的主要目标，因为大多数RNA分子存在于细胞核和细胞质中；而聚糖则来自与细胞膜结合的亚细胞结构，且糖蛋白和糖脂都位于细胞表面。但在【Cell | N糖修饰的小RNA分布在活细胞表面】一文中，作者突破了过去的常规认知，发现了新型生物分子——糖RNA（glycoRNA）的存在，很可能揭示了过去完全未知的生物途径。套索肽是由核糖体合成和翻译后修饰的肽。套索肽N端的核心肽与侧链上的天冬氨酸和谷氨酸依靠异肽键形成一个7-9个氨基酸的环，之后C端6-25个氨基酸的肽会穿过这个环形成套索的结构。在【J. Am. Chem. Soc. | 套索肽中的琥珀酰亚胺修饰】一文中，作者利用自己课题组此前开发的基因组挖掘算法定位到了两个套索肽的基因簇，经过异源表达后发现其质量与理论值有一定的减少。最终经实验验证两个套索肽中存在琥珀酰亚胺的结构，这一结构是合成基因簇中与PIMT酶基因高度同源的基因催化的。同时，这类套索肽序列上的一些氨基酸和C端的氨基酸序列对套索肽的形成具有重要的辅助作用。CO2为一种常见的生物体相关的气体分子，它除了被少数几种直接响应无机碳的蛋白识别外，还可以与血红蛋白等通过氨基的相互作用产生翻译后修饰。此前，Cann教授组曾经证明了三乙基氧鎓离子(TEO)能够捕捉CO2的同时，可以通过氨甲酰化作用在氨基上产生修饰，并成功鉴定了拟南芥中能够结合CO2的七种蛋白。在【Sci. Adv. | 泛素是一种CO2结合蛋白】一文中，作者结合TEO捕获以及NMR验证等实验证实在哺乳动物细胞中泛素蛋白能够通过形成氨甲酰化的方式结合二氧化碳，并发现了Ub在响应CO2变化中的作用。
甲醛作为常用的蛋白质交联试剂，能够在蛋白质的亲核性残基（如赖氨酸）之间形成交联，使蛋白质变性失活。然而在【陈鹏课题组发现甲醛“激活”蛋白质的独特化学修饰】一文中作者发现枯草芽孢杆菌中的转录因子HxIR能通过Cys11和Lys13识别甲醛，并形成分子内的亚甲基桥，实现转录激活。说明“分子内交联”这一独特的化学修饰，可能与蛋白酰基化、烷基化等翻译后修饰类似，能够调控蛋白质的活性与功能。以上为王初课题组2021年分享的文献中有关翻译后修饰的内容，欢迎大家交流与学习。下面为本文未涉及到的2021年PTM功能相关的推送，供感兴趣的读者查阅。 Nature | 内质网蛋白识别微管蛋白密码的机制
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