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作为一个功能强大且使用简便的基因编辑工具，CRISPR-Cas9 在医疗、农业等科研领域方面都有着巨大潜力，然而，这种基因编辑技术也并非完美，其面临着脱靶率、安全性，以及长序列修复等难题需要克服。 尤其是脱靶效应 —— CRISPR-Cas9 可能会在错误的位点切割 DNA 双链造成未知的潜在风险，而这也是限制其进入临床应用的关键因素。因此，如何降低 CRISPR-Cas9 脱靶效应是当下迫切需要解决的难题。 近日，针对这一难题科学界有了新的发现。得克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员揭示了导致 CRISPR-Cas9 基因编辑系统脱靶的分子结构机制，他们重新设计了 Cas9 蛋白的关键组件，与原始 Cas9 蛋白相比，在编辑效率不变的前提下将脱靶概率降低了数千倍。 目前，他们的这项研究成果以 “Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR-Cas9”（CRISPR-Cas9 错配监测的结构基础）为题在线发表于 Nature。
图｜论文截图（来源：Nature）
发现：“手指状结构” 是导致脱靶的根源CRISPR-Cas9 通过 gRNA（向导 RNA） 将 Cas9 蛋白靶向目标 DNA 序列，以对目标 DNA 双链进行切割，从而实现基因编辑。在这个过程里，含有 20 个碱基对的 gRNA 通过与目标 DNA 碱基互补配对来识别需要编辑的位点。 然而，20 个碱基对中，在其他碱基配对正确但最后 3 个（第 18-20 个）碱基不匹配时，Cas9 蛋白能进行 “纠正” 并继续编辑，这就会导致 CRISPR-Cas9 系统出现脱靶效应。至于 Cas9 蛋白到底是如何进行 “纠正” 的，其分子层面的运行机制是怎么样的，这些还有待进一步探索。 在这项新研究中，论文的共同通讯作者、得克萨斯大学奥斯汀分校分子生物系助力教授 David Taylor 和 Kenneth Johnson 联合开发了一种名为 “动力学引导结构测定” 的技术，该技术使用得克萨斯大学奥斯汀分校 Sauer 结构生物学实验室的低温电子显微镜（Cryo-EM）来观察与分析 Cas9 蛋白在与错配的 DNA 相互作用时分子层面的结构变化。
图｜得克萨斯大学奥斯汀分校分子生物系助理教授 David Taylor（来源：UT-Austin） David Taylor 于 2013 年在耶鲁大学获得分子生物物理学和生物化学博士学位；2014 年进入加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna 实验室从事博士后工作，期间他利用低温电子显微镜研究了 CRISPR 复合物的结构；2016 年，他开始在得克萨斯大学奥斯汀分校分子生物系担任助理教授职务，同时他也是 Sauer 结构生物学实验室主任。 据了解，Sauer 结构生物学实验室拥有全球领先的低温电子显微镜设施，能够以原子或接近原子的分辨率对蛋白质等一些大分子进行成像。早在 2020 年 2 月，该实验室利用低温电子显微镜全球首次创建并报道了新冠病毒刺突糖蛋白的原子级 3D 结构模型。 在此次的研究中，David Taylor 团队发现，当 gRNA 在第 18-20 个碱基出现错配时，配对结构会变得比较松散，但 Cas9 蛋白并没有停下来，而是通过一个 “手指状结构” 牢牢结合这个错配区域，从而在分子层面稳定了 RNA-DNA 双链结构，使其看起来像是正确的配对，进而继续对 DNA 进行切割，最终导致了脱靶效应的出现。 具体而言如下图所示，左侧为 Cas9 蛋白寻找与基因模板（粉红色部分）匹配的特定 DNA 序列（红色和绿色部分）。当 Cas9 蛋白找到正确配对时（右上角），它会继续切割和修改 DNA 序列；当 Cas9 蛋白在 DNA 的某个部分中遇到错配时（右下角），它并没有停止，而是通过一种 “手指状结构”（青色部分）来牢牢抓住 DNA 并保持稳定，使其表现得如同正确序列一样。
图｜CRISPR-Cas9 脱靶效应的分子机制（来源：UT-Austin） “这就好比，椅子的某条腿断了，若只是用胶带把断掉的腿粘在一起，虽然椅子又可以使用，但会摇摆不定，最终还会再次断开，所以这并不能算是完美的修复。” 论文第一作者、得克萨斯大学奥斯汀分校分子生物系博士 Jack Bravo 说道。 对于这一发现，David Taylor 也表示非常震惊，他表示：“如果不是通过低温电子显微镜亲眼看到 Cas9 蛋白在 gRNA 错配时出现这种手指状结构，我可能永远也想象不到它到底是怎么来稳定错配结构的，这些是先前从未有过的发现。”
研究：重新设计 Cas9 蛋白提高靶向性通常来说，配对错误会使 DNA 变得松散、不稳定，而 Cas9 蛋白的这种手指状结构使 DNA 保持稳定。这也就意味着，如果能够通过某种方式破坏掉该部分 DNA 的稳定性，那 Cas9 蛋白就不会切割和编辑 DNA，也就不会导致脱靶现象了。 基于这个发现，研究团队对 Cas9 蛋白进行了重新设计，将其手指状结构部分被改造成远离 DNA。如此一来，在出现错配情况时，Cas9 蛋白无法对错配的结构进行 “加固”，进而就不会在在错配的位点对 DNA 序列进行切割和编辑，从分子层面解决了脱靶的出现。
图｜研究团队重新设计 Cas9 蛋白以降低脱靶（来源：论文） “我们把全新设计的这种 Cas9 蛋白称为'SuperFi-Cas9’，这是一种高保真蛋白变体，它脱靶的概率比天然 Cas9 蛋白要低约 4000 倍，而且编辑速率与天然 Cas9 蛋白一样快，大幅提升了基因编辑的安全性。”Jack Bravo 说道。 据了解，目前，很多实验室重新设计了 Cas9 蛋白以减少脱靶效应的产生，但这些方法大多都是通过牺牲速率来提高准确率。 对此，Jack Bravo 做了个比喻，“如果将不同实验室设计的各种版本的 Cas9 蛋白看作是不同型号的汽车，这些 Cas9 虽然比天然 Cas9 更为安全，但也付出了很大的代价，即它们就像是被限速了一样，行驶非常缓慢。而我们的 SuperFi-Cas9 就像一辆全新设计的汽车，它不但安全，而且还可以高速行驶。” 目前，研究团队已经验证了 SuperFi-Cas9 在试管中对 DNA 的编辑快速且精准；现阶段，他们正在活细胞中进行 SuperFi-Cas9 基因编辑试验；接下来，他们还将基于这项发现继续开发更安全、更高效的新型 Cas9 蛋白。
展望：减少脱靶效应将加速 CRISPR 进入临床应用
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