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MSCs不仅可以下调免疫应答强度以调节机体的先天性免疫与适应性免疫，而且还可以促进血管生成、抑制细胞凋亡。近几年，MSCs已然成为生命科学研究的热点之一。然而，MSC细胞的培养却非易事，成功建立可靠的MSC细胞培养操作体系往往需要处理好各种操作细节。 对脐带分离MSC细胞的实操感兴趣的朋友，可以点击链接：历史文章-脐带分离原代MSC细胞操作步骤 MSC细胞复苏 1、仪器设备、耗材及试剂 仪器设备：超净工作台一台、二氧化碳培养箱一台、水浴锅一台、低温离心机一台、显微镜一台、1mL电动移液枪、电动移液器。 耗材：镊子、15mL离心管、细胞培养瓶、10mL移液管。 试剂：MSC培养基础培养基、MSC培养完全培养基、台盼蓝染色液。 2、细胞复苏操作步骤 实验前准备 细胞培养基置于4℃平衡，水浴锅预先调至37℃，离心机开机预冷至4℃。 细胞复苏 a. 从液氮罐中取出冻存管，如有液氮渗漏进冻存管内，先稍微拧松管盖，让气化的液氮逃逸（否则冻存管有爆炸危险）。 b. 用镊子夹住冻存管，浸入37℃温水中（注意管口不要浸入液面以下），并不时摇动，待管中冰核溶解至黄豆粒大小时拿出，酒精擦拭后转移至超净工作台内。 注：该步骤对细胞存活率至关重要，既要尽快融化，减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间，以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在水浴锅中不管。 c. 将冻存管内细胞悬液（约1mL）转移至装有（约14ml）4℃预冷MSC培养基础培养基的15mL离心管中，上下颠倒混匀（所有操作轻柔缓慢，以防损伤细胞）。 d. 4℃，210g，离心4min，吸去上清液，加入1mL MSC培养完全培养基重悬混匀。 e. 取出10uL细胞悬液用PBS稀释一定的倍数，取10μL稀释后的细胞悬液加入台盼蓝染色液，显微镜下计数；根据计数结果及所使用培养基推荐的接种密度（如使用达优GF20培养基，推荐接种密度4000-5000个cells/cm2）计算所需细胞悬液体积。 f. 用移液枪轻柔吹打几次细胞悬液，避免细胞聚团导致细胞接种不均匀。培养瓶中加入适量完全培养基，再加入计算好体积的细胞悬液。将培养瓶置于工作台上，“8”字形前后左右轻晃多次，使细胞在培养瓶中均匀分布。将培养瓶放入37℃ CO2培养箱中进行培养。 MSC细胞传代 1、实验设备、耗材及试剂 仪器设备：超净工作台一台、二氧化碳培养箱一台、显微镜一台、水浴锅一台、低温离心机一台、1mL电动移液枪、电动移液器。 耗材：15mL离心管、细胞培养瓶、10mL移液管。 试剂：MSC培养完全培养基、胰酶、DPBS、台盼蓝染色液。 2、传代操作步骤 实验前准备 将MSC培养完全培养基避光平衡至室温。 细胞传代 a. 从培养箱中取出细胞培养瓶，显微镜下观察细胞汇合度、形态等，并进行记录拍照（根据需要，拍摄倍数40倍或100倍）。 b. 汇合度80%-90%时即可进行消化传代（汇合度过高会影响细胞后续状态）。 c. 酒精棉球擦拭细胞培养瓶后（注意酒精不要进入瓶盖内膜上），转移至工作台内，移去细胞培养瓶内培养基。 d. DPBS清洗细胞培养瓶1-2次，每次2-3mL（视培养瓶大小而定）。 e. 加入胰酶消化液 500μL（不同大小培养瓶胰酶用量参考表1），拧紧瓶盖，稍微倾斜瓶身，使胰酶均匀覆盖瓶底，37℃培养箱放置30s-1min，肉眼可见细胞呈白茫状脱落，显微镜下观察细胞大部分脱落后，尽快放回工作台。向细胞培养瓶中加入MSC培养完全培养基终止消化（培养基体积大于加入胰酶体积的3倍即可，应及时进行终止，避免消化过度）。 MSC培养完全培养基与胰酶的推荐用量  f. 如有未脱落的细胞，使用移液管轻微吹打几次瓶壁，使细胞脱落。将细胞悬液转移至15mL离心管中，210g室温离心4min。 g. 离心后，可见管底出现白色沉淀，酒精球擦拭离心管后转移至工作台内。移去上清，加入适量新鲜的MSC培养完全培养基重悬细胞（500μL-1mL左右），用移液枪量出管内总体积数，可将体积数写在对应管盖上，取出10μL进行台盼蓝计数。 h. 根据计数结果及所使用培养基推荐的接种密度，计算所需细胞悬液体积。具体接种密度视细胞代数、增殖速率、实验所需传代天数而定（根据实验经验来），通常建议三天传代一次较为合适，可以保证细胞达到最高的增殖效率。 i. 用移液枪轻柔吹打几次细胞悬液，避免细胞聚团导致细胞接种不均匀。细胞培养瓶中加入适量MSC培养完全培养基，再加入计算好体积的细胞悬液。将细胞培养瓶置于工作台上，“8”字形前后左右轻晃多次，使细胞在培养瓶中均匀分布，后放入37℃ CO2培养箱中进行培养。 MSC细胞冻存 1、实验设备、耗材及试剂 仪器设备：冰箱一台、液氮罐一个、显微镜一台、低温离心机一台、1mL电动移液枪、电动移液器。 耗材：15mL离心管、10mL移液管、细胞冻存管、细胞程序降温冻存盒。 试剂：MSC培养完全培养基、无血清细胞冻存液。 2、冻存操作步骤细胞 实验前准备 a. 细胞冻存管放入-20℃平衡，细胞程序降温冻存盒、MSC培养完全培养基、无血清细胞冻存液放入4℃平衡。 b. 将备用的细胞冻存管做上详细的记号，比如细胞代次、冻存时间、冻存密度等。 细胞冻存 a. 对要冻存的细胞按照上述传代操作中的实验步骤进行消化处理，将细胞悬液加入15mL离心管中4℃，210g，4min，加入适量4℃平衡过的MSC培养完全培养基（500μL-1mL左右）进行重悬计数。 b. 根据细胞计数的结果加入4℃平衡过的的MSC培养完全培养基（冰上操作），将细胞浓度调整至冻存所需的密度（即冻存液推荐的密度）。如使用达优2X无血清细胞冻存液，推荐的冻存细胞密度为1×106-1×107 cells/ mL 。如果冻存密度为1×106 cells/mL，即用培养基将细胞密度调整为2×106cells/mL。 c.（冰上操作）缓慢逐滴加入冰浴过的无血清冻存液（加入的体积参考所使用的的冻存液说明书，如使用达优无血清细胞冻存液，此处为等体积加入），轻轻混匀（注意：一定要逐滴加入，以避免溶液中DMSO浓度的剧烈变化，引发细胞损伤）。 d. (冰上操作)以每管1mL细胞悬液的量分装入在经-20℃平衡过的细胞冻存管，然后将细胞冻存管的盖子拧紧。 e. 立即将冻存管放入已在4℃平衡过的细胞程序降温冻存盒，然后将该冻存盒放入-80℃冰箱。 f. 过夜后，将细胞转移至在液氮罐中，并在液氮设备管理单上记录细胞的放置位置。 |
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