自20世纪初Ｒｏｈｍ公司开发酶软化和酶脱毛工艺以来,酶制剂在制革工业中的应用经历了一百余年的发展历程,但迄今仍未成为制革准备工序的主流技术。20世纪90年代,随着世界各国环保政策的日趋完善和对环境保护的高度重视,皮革工业正面临着有史以来最严重的生存危机。以酶为基础的制革生物技术在清洁性、环境友好性方面独具特色。用这类技术取代传统化学:制革工艺,是从根本上解决制革工业严重污染的有效途径。同时,酶在制革工业中的应用将推动酶工程在极端条件反应动力学及相关理论的发展,拓展酶应用的领域。本文追溯近二十年酶在制革工业中的应用发展历程,展望了未来发展的趋势。
1酶在制革工业中应用
随着人们对酶性质、酶促反应动力学的深入研究以及新酶种的不断发现和现代发酵技术的发展,酶在制革工业中的作用机理及应用的研究已成为制革清洁化技术的热门方向之一。
1.1酶助浸水的研究与应用
1.1.1酶在浸水过程的作用机理与常规浸水方法比较,酶助浸水的特点是以蛋白酶为主浸水助剂,通过间质蛋白和蛋白多糖的酶促降解,尤其是使透明质酸(Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ)、硫酸软骨素(ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆｕｒｉｃａｃｉｄ)等降解,使原皮快速、有效回水。在酶助浸水作用前,必须使纤维间质润胀到一定程度,才有利酶促间质蛋白的降解。添加适量的非离子表面活性剂有利于间质的润胀。此外,碱性蛋白酶、碱性脂肪酶和表面活性剂以适当的比例配伍构成的浸水助剂不仅有助于纤维间质的除去,而且脱脂率也较常规的化学和单一酶的酶助浸水方法高。影响浸水效果的因素有原料的性质、浸水液的ｐＨ、液比、温度、浸水助剂的质量浓度和浸水时间等。尤其以浸水温度和时间对浸水效果的影响最大。
1.1.2酶在浸水过程的应用酶在浸水过程中应用的研究始于20世纪80年代,胰蛋白酶[1]、细菌蛋白酶[2-3]在浸水过程中应用结果表明,酶浸水可以使吸水速率增大,浸水均匀,有效地除去纤维间质,弹性蛋白被部分降解,使胶原纤维适当分散。在其后的浸灰工艺中,促进了灰碱的渗透和均匀膨胀。成革柔软,减少了成革血管痕、肥纹和边腹空松[4]。在浸水液中加入碱性脂肪酶,表面的脂肪被降解,有益蛋白酶松动表皮、降解脂肪细胞壁,结果是脂肪酶和其它浸水助剂渗入原皮内部[5],达到良好的脱脂效果,浸水更均匀,在浸灰过程中促进碱膨胀和脱毛,所得成革粒面毛孔清晰,粒面光滑、清洁而富有弹性,得革率增加[7,8]。在浸水过程中添加浸水酶时,对浸水的温度和浸水液的ｐＨ值要严格控制,并要求与之同时使用的其他材料对酶无抑制作用。由于浸水酶往往对胶原也有一定的作用,因此其用量要严格控制,协调好用量与作用时间之间的关系。对于品质差、防腐差的原料皮要慎重使用浸水酶助剂。
1.2酶脱毛机理及其应用的研究
1.2.1酶脱毛机理的研究1922年Ｗｉｌｓｏｎ和Ｄａｕｂ首先应用显微镜观察到“发汗法”脱毛过程中细菌活动的情况,标志酶脱毛机理的研究的开始[9]。有关酶法脱毛机理的研究大致分为二个阶段,第一个阶段是在显微水平上对表皮和毛根组织的观察,第二个阶段是在化学水平上,对脱毛过程中毛囊、马氏层细胞组织间的蛋白质的水解及其与脱毛的关系的观察和研究。前者的研究结果表明,马氏底层细胞、毛囊基础细胞的分解、毛髓的部分水解导致了毛的松动及在机械作用下脱落。后者的研究结果表明,使表皮和真皮之间的类粘蛋白、粘蛋白、清蛋白、球蛋白等降解是酶脱毛的基础。酶法脱毛和碱法脱毛在原理上有共同之处,即在碱或酶的作用下,使类粘蛋白等溶解,从而削弱毛和表皮与真皮之间的连结。用单一的酶制剂进行的酶脱毛机理的研究结果表明,酶脱毛的能力和催化肽键断裂的能力有关,催化肽键断裂的能力越强,则脱毛的能力越好[10],用于脱毛的酶制剂应该具有相对专一性(ｇｅｎｅｒａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ)、内切酶活力较高且均一的特点。
这些研究成果对脱毛酶菌种的选育、酶种的选择及应用技术的开发具有很大的指导意义,但由于客观条件的限制,上述机理未能就胶原的水解与脱毛作用的关系作出合理的解释和定量描述,亦无法提出解决因胶原的水解对皮组织损害的措施。了解与细胞相关的复杂蛋白质在酶作用时的变化以及这些变化与细胞水解的关系,对筛选理想的制革专用酶制剂是很重要的。对酶的不同组分的脱毛效果、水解液分析等研究结果表明,酶脱毛中起主导作用的是非胶原蛋白水解酶。酶的脱毛能力与水解专一性有关,具有相对专一性的蛋白酶具有较强的脱毛能力。基膜提取物中的250ＫＤ、型胶原和血清白蛋白的水解与脱毛有因果关系[10]。有关酶助脱毛机理的一个新的解释是,在有蛋白酶存在的条件下,毛的中心成分毛髓被溶解,使脱毛剂沿着毛发的内部进入毛囊的底部,在其毛球部和前角质区使毛降解,毛从根部脱落。毛杆分离和崩溃后,机械作用使残存的毛发从毛囊完全除去[11]。设计一个合理的脱毛酶体系的充要条件是,确切地了解要使毛恰当松弛,毛囊何种组分应该被破坏。关于脱毛过程中酶的最适ｐＨ值的问题实际上是所表征活力和稳定性的综合的考虑,这是因为脱毛酶体系实际上是一个多酶的体系。有关酶的浓度、温度和碱预处理对脱毛效果的作用,可以通过脱毛液中的总氮及蛋白多糖含量的变化来确定。以酪素或胶原为底物所测得的酶活力能较好地反映该酶制剂的脱毛能力。
其实,以任何相对单一的底物表征的酶活力与该酶制剂的脱毛能力之间是不可能存在显著的相关性的。在脱毛过程中,要破坏的毛囊的组分是多样性的,从这一特性考虑脱毛酶应该是一类具有相对专一性的蛋白酶,该类蛋白酶的主要组分是内切肽酶类,在脱毛过程中能够尽可能多的使肽键断裂。此外,酶通过皮结构渗入到作用区域的能力对酶脱毛的效果也是至关重要的,酶从皮表层渗入到作用区域所需的时间占整个脱毛时间的70%[12],由此可见,脱毛酶制剂至少应由两部分组成,一部分是有助于将降解毛囊细胞的成分扩散或输送到作用区域的成分;而另一部分则是使毛囊细胞降解的成分。从理论上讲,在原皮坯中影响酶渗入的组分应该是透明质酸和皮肤软骨素等,实际上,影响酶通过纤维结构渗透速率的因素是粘结物质的性质、成分和条件及原皮坯的厚度。基膜粘度的变化对脱毛速率几乎没有影响。已证明蛋白酶的水解作用是减少蛋白多糖(透明质酸-蛋白质复合物)的粘性,透明质酸没有任何解聚也不影响皮组织的可渗透性[12],这可能是脱毛酶的蛋白水解作用对于降低基膜粘性和便于酶本身扩散是独特的,因而不需要透明质酸酶协助。蛋白酶的松毛作用是以粘液层(基底层)的非结构血浆蛋白的水解为基础,蛋白水解使乳头层和表皮层之间的连接松弛毛被除去。
1.2.2酶脱毛技术的应用Ａｒａｚｙｍ酶法脱毛工艺的发明,开创了酶脱毛技术研究与应用的先河,并在当时的制革工业界引起强烈反响。随着历史的变迁,酶在脱毛工艺中潮起潮落,迄今仍未成为皮革脱毛的主流技术。从20世纪90年代开始,世界各国的皮革工业均感受到了来自环保方面问题的困扰,酶脱毛的研究和应用再次呈现生机。常规的硫化钠脱毛工艺主要是利用Ｎａ2Ｓ/ＮａＨＳ还原破坏角蛋白的双硫键,从而破坏角质蛋白分子的结构稳定性,在碱性条件下将角蛋白的肽键水解成分子量较小的肽或氨基酸,使毛、毛根屑、表皮被溶解而除去。这类工艺会给环境造成严重的污染,酶法脱毛作为有希望的替代工艺,其研究与应用引人注目[13-18]。其中余义先生[18]撰文介绍了我国二十年酶法脱毛的发展史及海宁制革厂取得的成功经验,推动了酶法脱毛应用的技术进步[19]。传统的酶法脱毛机理认为,用于脱毛的蛋白酶应不含或尽量少含胶原蛋白酶以免损伤真皮的胶原。一种商品名为ｄｉｓｐａｓｅ的细菌中性蛋白酶对基膜的胶原组分Ⅳ具有专一性,应用在牛皮的脱毛工艺中,能使毛发松弛而不损伤真皮的胶原纤维[19]。中性蛋白酶ＡＳ1.398和碱性蛋白酶2709在制革工业中的应用已有数十年的历史,由于对胶原蛋白的水解能力较强,妨碍其广泛应用。
ＡＳ1.398与2709以适当比例配伍,并根据原料的性质对其作用温度、时间和ｐＨ等操作条件优化,在有温有浴脱毛过程中,胶原蛋白的损失降低60%以上。为新型生物脱毛助剂的开发提供了值得参考的方法[20]。针对秦川黄牛皮硫化物和脱毛酶同浴浸灰存在脱毛未尽、出现松面的问题,添加少量硫化物对其进行预处理,在使用1398中性蛋白酶进行脱毛处理时,添加0.2%的酚类助剂。与对照方案比较,酶用量减少,其脱毛作用增强,松面程度降低,所得成革脱毛干净,粒面清晰无明显损伤,革身丰满、柔软、弹性较好[21]。在鲁西黄牛的浸灰过程中添加2709碱性蛋白酶,除去了包裹在胶原纤维表面的硫酸软骨素等蛋白多糖,使真皮上层致密的胶原分散。浸灰时间从18ｈ降至8ｈ,减少了松面的发生[22]。陈敏等开发的一种酶糊用于猪皮的滚置脱毛研究表明;该酶糊在26-38℃范围具有脱毛效果好,皮损伤小的特点[23]。滚酶堆置脱毛对减少皮张的部位差,尤其对猪皮非常有效,而且具备反应易控制、工艺比较成熟、反绒革绒面细而密、环境污染小等特点。但卫华等采用板块模式、层次分析和正交试验等数理方法分析影响脱毛效果的主要因素,优化臀部涂酶工艺条件,开发了以166中性蛋白酶和胰酶构成的复配酶-碱脱毛新工艺,在猪服装革的生产中应用取得了良好的效果[24,25]。在耐水洗、耐干洗猪反绒服装革的生产工艺中,采用酶助浸水和包酶、浸酶脱毛工艺也获得成功[26]。随着对酶法脱毛工艺的重视,筛选脱毛能力强,对胶原纤维损伤小的制革专用菌种及新型生产工艺的研究开发工作也引起了高度的重视。刘彦等从自然界中筛选到耐盐性强的菌株和具有高浓度Ｃａ2+耐受能力强的碱性蛋白酶菌株各一株,其中高浓度Ｃａ2+耐受能力强的菌株(Ｂａｃｉｌｌｕｓ.ｓｐＮｏ8),蛋白酶的最适ｐＨ为9.6,最适温度40℃。在ｐＨ10.6-11.6最稳定,制革生产过程中常用的ＪＦＣ在其用量范围对酶活无抑制作用[27-29]。在山羊皮、绵羊皮的脱毛过程中使用Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙａ[30]、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔａｍａｒｉｉ[31]、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＦａｅｃａｌｉｓ[32]、Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｕｓｆｌａｖｕｓ[33],ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｇｒｉｓｅｕ[34]等真菌和放线菌的碱性蛋白酶制剂的研究表明,这些酶制剂对原皮的胶原纤维损伤小,脱毛效果好,基本不松面;所得成革质量较灰碱法的高。固态培养技术具有投资少,单位容积产率和产量高、生产成本低等深层发酵无法比拟的优势,制革用酶制剂对纯度要求不高,所以近十年固态培养技术已逐渐在制革酶制剂的生产中开始应用[35]
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