|
大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。 概述： 基因表达模式的变化可能是由于在DNA序列不变的情况下基因组发生的修饰而引起的; 这些修饰包括胞嘧啶甲基化生成5-甲基胞嘧啶(5mC)，从而产生可遗传的表观突变和新的表观等位基因。这种类型的非序列变异称为表观遗传学。哺乳动物中负责产生这种DNA修饰的酶被命名为DNA甲基转移酶(DNMT)，包括DNMTI、DNMT2和DNMT3。这些修饰可经TET蛋白催化进一步氧化，TET包含2-氧戊二酸依赖的双加氧酶家族催化结构域。在胚胎干细胞、肿瘤细胞和脑组织在内的各种哺乳动物细胞/组织中，已经证实这些蛋白能够诱导5-甲基胞嘧啶逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。从初始甲基化到DNA去甲基化过程的每个阶段都可能是调控基因表达的特异性表观遗传标记。该篇综述了不同植物中关于DNA甲基化氧化产物，特别是DNA羟甲基化5hmC的修饰情况，虽然目前存在争议。一些文献认为植物中没有DNA去甲基化酶；另一些文献结果认为，DNA甲基化氧化产物是主动去甲基化过程形成的，并认为植物中可能存在TET类似的蛋白，促使氧化产物的形成，以调控基因表达。在这里还总结了在植物中转基因表达人TET保守催化区域的研究结果。 1、简介 甲基化胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)是大多数真核生物中常见的表观遗传标记，参与了许多已被广泛证实的生物学过程。它被认为是哺乳动物和其他基因组DNA中的第5碱基。大量文献已经阐述了DNA甲基化在转录和转录后基因沉默以及染色质重塑中的核心作用。这表明，通过siRNA在细胞核中的潜在作用，甲基化的方向与异染色质形成有关。细胞核siRNA介导的甲基化与异染色质的形成有关。这一过程涉及siRNA介导互补RNA scaffold的形成，以招募调控组蛋白尾部共价修饰的蛋白和DNA甲基转移酶。随后，siRNA沉默转录并介导染色质结构的修饰。此外，与之前的研究一致，在异染色质和siRNA簇中发现的显著的DNA甲基化修饰对转座子沉默也发挥关键作用。最近的另一项研究解释了DNA甲基化对内源性基因表达的直接调控作用。 大量研究表明，植物基因组一系列表观遗传修饰参与植物生长和发育的调控，以及在植物和动物普遍存在的重要调控——基因组印记。DNA和组蛋白甲基化，尤其是4、9和27位赖氨酸甲基化修饰与DNA和组蛋白的其它修饰相比，如乙酰化、磷酸化和泛素化修饰等，是植物表观遗传标记更重要的修饰方式。此外，在高等植物的基因组中，5mC非常普遍存在，发挥着包括基因表达调控在内的多个作用，对于转座元件的转座和激活承担重要调控作用，高频率的表观遗传修饰可以显著减少转座元件的转座。5-mC在植物发育过程中也起到调控基因表达的重要作用。 胞嘧啶甲基化主要发生在CG二核苷酸位点，尽管CHG和CHH位点在植物中也可显著甲基化。该表观遗传的水平及其碱基位置在植物和动物之间存在显著差异。例如，尽管人类基因组中总胞嘧啶的甲基化总体水平相对较低（约4%），但大多数(60-80%)的CG二核苷酸都发生了甲基化。甲基化修饰频率和模式因细胞类型不同而存在显著差异，在不同疾病中也存在差异。与哺乳动物基因组整体甲基化修饰频率较低不同，在植物中，基因组中的胞嘧啶甲基化水平较高，约为5-25%。例如拟南芥，CG、CHG和CHH位点发生甲基化的概率分别为22.3%、5.92%和1.51%。 下文主要评估植物基因组中是否存在5mC氧化衍生物相关的证据，并考证植物中是否含有与动物类似的TET蛋白酶等假说。 2、5mC去甲基化酶（erasers） 表观遗传修饰包括表观基因组的DNA甲基化，可以通过DNA甲基化酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和识别蛋白的不同活性来维持和翻译。总的来说，这些蛋白在动物和植物中均负责识别和解读这些表观遗传信息。 尽管5mC甲基化参与调控转录和生长发育，但植物和动物中的5mC甲基化可被被动地清除，例如如果复制链没有及时发生甲基化修饰，复制链DNA的甲基化在随后的着丝粒分离而消除；也可能通过相应酶的作用而主动去甲基化。这种主动去甲基化建立在至少三种假设途径上，(i)直接从胞嘧啶环上去除甲基基团，(ii)甲基化胞嘧啶的自我切除，(iii)5mC残基的化学修饰和重构。哺乳动物和其他高级多细胞动物的去甲基化可以通过酶的功能完成，如TET家族酶。这些酶逐步将5mC氧化为5羟甲基胞嘧啶(5hmC)、甲酰胞嘧啶(5fC)和羧基胞嘧啶(5caC)。DNA动态去甲基化相关主题文献资料也有类似报道，它阐述了5fC和/或5caC是DNA甲基化5mC通过TET连续氧化的产物，并可随之通过碱基切除修复(BER)途径去除（图1和图2）。这一过程最初涉及DNA乙二醇酶，校正因甲基化、氧化或脱氨基作用导致的小的碱基损伤。该酶移除受损的碱基，留下一个脱碱基位点，随后或通过短程修复或长程修复进行修饰。  编辑  编辑切换为居中 从功能上看，所有TET家族成员均具有激活基因转录活性的调控作用。例如，在胚胎干细胞(ESC)分化过程中，TET蛋白和5hmC被强烈的调控。有一种假说认为，在ESC细胞中，5hmC是在特定生理条件下TET酶形成的，并且获得很强的证据支持。此外，研究人员还发现，三种不同的TET蛋白在小鼠中表现出不同的表达模式，但与所有哺乳动物一样，这三种蛋白具有共同的结构特征。这些特征包括一个富含半胱氨酸的区域，一个C-末端催化结构域，包括一个双链β-螺旋(DSBH)或具有HXDXnH基序的桶装cupin fold折叠（图3）。 研究还表明，TET1通过与Nanog基因的启动子相互作用，形成启动子超甲基化平衡，在胚胎干细胞中维持干细胞状态中发挥作用。TET1和TET3都有一个被确定为CpG结合基序的CXXC DNA结合域，并可能促使TET成员向DNA的聚集。近期研究发现，通过突变人TET2的一个保守区域位点Thr1372残基能够使该蛋白以氧化5mC为5hmC为主，几乎不形成5fC或5caC，从而显著改变了底物的偏好性。  编辑切换为居中 3、DNA甲基化模式变化的遗传效应 5hmC的重要性和TET基因在哺乳动物和其他后生动物中普遍存在已得到广泛研究。连同5mC修饰，5hmC修饰在许多特定的基因组功能上发挥显著的作用，例如哺乳动物和其他物种受精卵的发育。例如，在启动子以及基因内区域（gene body）中5hmC发生高水平修饰。其他相关研究观察到5hmC更易发生在基因体上。且与内含子相比，5hmC修饰碱基在外显子中更为丰富。综上所述，5hmC被认为是调控基因表达的重要因素，5hmC的存在与基因表达上调高度相关。此外，该生物标志物在发育和神经元活动中的功能作用也得到了阐明。在小鼠小脑浦肯野神经元中，5hmC的丰度接近5mC的40%，而脾脏和胸腺5hmC修饰的水平较低(5-15%)。同时也发现5hmC丰度与细胞增殖呈负相关。2010年和2011年先后发表两篇文献首次揭示DNA羟甲基化修饰功能重要性以及其在胚胎形成中对于维持多能性的关系。一项关于小鼠受精卵父系基因组DNA去甲基化的胚胎发生研究表明，受精后基因组印记基因和失活X染色体去甲基化的激活，伴随DNA甲基化的活跃动态变化和重塑。此外，神经回路活性与DNA修饰的关系显示DNA去甲基化在调节成人大脑神经发生中的积极作用。一项关于人乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的发生与5hmC水平和TET基因表达水平的关联分析的研究发现，5hmC与肿瘤的发生存在广泛而紧密的联系。Tet基因家族表达降低可显著降低5hmC的修饰水平。综上所述，所有这些证据以及其他研究均显示了5hmC在胚胎形成和哺乳动物组织发育中的重要作用。然而，在植物中是否存在主动酶反应去甲基化过程、什么酶可能参与、DNA羟甲基化修饰在全基因组分布如何，以及5hmC表观修饰在植物中的功能作用等都尚不清楚。 在植物中，研究人员对于DNA甲基化5mC基因组分布、DNA甲基化对基因表达的影响、以及DNA甲基化在物种形态特征和胁迫环境适应性等方面的生物学功能研究，已有大量的研究报道。例如，蒺藜苜蓿DNA甲基化研究显示，在盐度胁迫下，植物跨基因结构重塑DNA甲基化5mC分布特征的能力。基因区域间以及5mC序列特征的不同，甲基化重塑特征不同，其中CG的甲基化使蒺藜苜蓿在耐盐机制方面，使特定的一些基因表达获得一些不确切的影响。另有研究表明，当棕榈根暴露于盐度条件下时，启动子DNA发生CG甲基化与基因表达呈负相关，而CNG/CNN发生甲基化与基因表达呈正相关。 至于植物去甲基化的相应现象，拟南芥存在一个螺旋-发夹-螺旋-甘氨酸/脯氨酸/天冬氨酸（HhH-GPD）DNA糖基化酶的亚家族，包括DME、ROS1、DML2和DML3，它们参与胞嘧啶主动去甲基化过程（图4）。 研究发现，DME因涉及DNA去甲基化而对种子发育过程必不可少。受精前雌性配子DNA甲基化的主动性转化调控必须在DME下完成。两项不同研究认为，在植物发育过程中，其它DNA甲基化5mC糖基化酶DML2、DML3和ROS1具有维持DNA甲基化的积累，保护基因免受潜在有害甲基化。  编辑 与后生动物相比，植物中存在5hmC相关的证据有限，这引发了鉴定5hmC以及TET类似酶功能相似物是否存在的争议。 4、 TET酶存在于植物中吗 TET酶是氧戊二酸/铁依赖性双加氧2-OG 酶成员，功能最多样化的非血红素酶超家族之一。该酶家族在原核和真核生物中普遍存在，参与多种的重要生物活动，包括植物产物和抗生素的生物合成、翻译后修饰、DNA/RNA损伤修复和脂质代谢。 例如，在植物中，这些酶的一个亚类包括花青素合成酶、黄烷酮3β-羟化酶和黄酮醇合成酶。这些特定的酶负责黄酮和次级产物的生物合成，他们在种子植物中广泛存在并发挥多种生理作用，包括对生物和非生物胁迫的适应。在这个过程中，黄酮类化合物通过调节植物的生育能力和调节植物重要激素，生长素，的转运来帮助植物应对外来胁迫。另一植物激素赤霉酸(GAs)的合成参与2(OG)-双加氧酶这类酶的活性，它们包含GA 20-氧化酶(GA 20ox)和GA 3-氧化酶(GA 3ox)。拟南芥突变体AtGA20ox1基因表达缺失使其节间长度变短，因此影响茎高。而在水稻(Oryza sativa)和大麦(Hordeum vulgale)的类似性状中，含有突变(如:半矮秆sd1)谷物GA20ox2已被育种家用于抗倒性，从而提高产量。 据报道，拟南芥基因组中存在130多个双加氧酶基因。这个双加氧酶超级家族包括一类存在于哺乳动物和植物，名为脯氨酰4-羟化酶（P4H）的重要催化酶。在哺乳动物中，这类酶已被充分研究，并根据其定位分为两种类型，包括位于内质网的胶原型P4H和位于细胞质的低氧诱导因子(HIF)-P4Hs。这些酶参与调控哺乳动物的表观遗传过程、代谢反应和可能的治疗应用。类似地，在植物中也存在大量编码这类酶的同源基因。例如，拟南芥中13个推定的P4H基因，编号从ATP4H1到ATP4H13。底物的多样性和大量功能未知的相关酶为植物负责主动调控DNA去甲基化的表观遗传进程提供了可能的植物2(OG)-双加氧酶（TET类似酶）。当然，该类酶仅是复合体的一部分，该复合体还要具备与TET酶CXXC结构域相当的DNA结合基序蛋白。 5、植物5mC氧化衍生物 此前的研究证实，糖基化酶可以通过BER部分途径直接从DNA骨架上去除5mC修饰，随之形成一个脱碱基位点。然而，当拟南芥中已知的去甲基酶发生突变时，并未影响其全局去甲基化程度，甲基化状态仅在某些特定的位点受到影响。此外，由于一些脱碱基位点的产生同时使DNA链破坏，BER通路可能不是引发基因组不稳定性的基因组整体去甲基化的主要途径。然而，在配子形成和胚胎发生的生殖过程中，仍不能确定是否存在整体去甲基化。与哺乳动物TET酶的去甲基化途径相比，植物中是否存在相同的去甲基化途径? 为了确定植物DNA中是否存在5mC的氧化产物，各种不同灵敏度和特异性的方法随之用于研究。一系列的研究使用了斑点免疫印迹和液相色谱-多级质谱（LC-MS/MS/MS）等方法来鉴定5hmC的存在，如表1所示。  编辑切换为居中 拟南芥叶片和花朵中检测到5hmC修饰的水平占总胞嘧啶的0.07%，暗含该衍生物来源于DNA复制后的被动去甲基化过程。与这一观点相一致，其他研究观察到极低水平的5mC迭代氧化，这与哺乳动物中的最低水平(0.15%-0.3%)相当，并认为检测到的5hmC是由非酶促的DNA去甲基化产生的。另一方面，也有研究认为5hmC的存在是5mC氧化后主动去甲基化的产物，而不是DNA氧化损伤的结果。 此外，在水稻的异染色质区域，特别是转座元件(TE)相关基因中发现了显著的5hmC富集。这一结果使研究人员认为染色质结构与5hmC水平之间存在显著关联。尽管一些研究结果显示5hmC来源于植物DNA被动去甲基化，但仍建议进一步研究明确5fC和5caC在内的其他氧化化合物。 基于这些疑问，一项综合研究运用化学衍生法与液相色谱/串联质谱分析相结合的方法，测定了拟南芥(A. thaliana)、番茄(Lycopersicon esculentum)、银杏(Ginkgo biloba)、侧柏(Platycladus orientalis)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)等植物样品中5mC的氧化产物。这项研究结果表明，不同组织基因组DNA中广泛存在进一步氧化产物，包括5fC和5caC。除了包括DNA糖基化酶途径结合BER途径的直接切除外，以上结果使研究者总结为：与哺乳动物DNA去甲基化途径相似，植物中也存在另一种DNA主动去甲基化的途径。此外，在干旱和盐胁迫条件下观察到植物基因组DNA不同水平的5fC和5caC修饰，暗含这两种表观遗传修饰在环境胁迫条件下的生物学功能。近年来，研究者运用LC-MS/MS研究了包括拟南芥等在内的不同植物RNA的5hmC修饰丰度。这些研究者确认了RNA中存在5hmC，并认为这种5hmC是由活性（酶）转化导致的，而且，他们认为5mC的氧化产物可能具有关键的调控功能。 如前所述，尽管在植物中已经检测到5mC的氧化产物，但依旧没有证据证实植物中有类似于哺乳动物TET家族蛋白类似的酶参与其中。在哺乳动物中Tet1、2、3基因功能冗余的证据上面也有陈述。人们普遍认为，这三个基因不存在于多细胞植物中，尽管植物界在许多方面与后生动物和真菌一样多样和复杂。Tet基因缺失假说的逻辑推理是不会存在5mC的氧化产物。然而，检测到5mC氧化衍生物的结果，使我们有必要认识到植物中一定存在另一种蛋白家族，他们负责DNA修饰的形成，他们的生物化学功能跟TET蛋白家族类似，因为氧化中间和末端产物，例如5hmC的存在。 6、转基因植物表达人源TET蛋白结构域 发现人源TET蛋白家族功能后，研究这些蛋白在植物中表达后的活性成为科学家关注的热点。第一个发表的研究是将人Tet3基因C端催化结构域，通过35S启动子控制，转化到拟南芥中。一个rDNA区域作为甲基化报告基因，研究发现，可以诱导低甲基化或高甲基化模式的等位基因。甲基化模式即使在去除转基因后也能稳定地保留下来。在TET3转化株中，检测到了5hmC标志物，表明转基因酶具有氧化能力。此外，5fC仅在具有DNA糖基化酶背景下的转化株中可检测到，这表明5hmC残基被人TET催化结构域进一步氧化为5fC。运用相同构思，该研究小组将这项工作扩展到番茄，他们制备了不同表型的转化株，包括叶片长度和数量的增加。研究者在这些转化株中发现CEN1.1，磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP) /centroradialis家族, terminal flower和self-pruning (CETS)的各种表达变化。这些变化与该基因在叶片中低甲基化及相应的基因激活有关。 另外三个研究小组发表了类似但更复杂的研究结果。在早期研究中，同样运用35S启动子控制人TET1蛋白催化结构域，转基因到拟南芥中。分析两个转化株显示，基因组整体CG甲基化水平下降，从野生型的18.2%分别下降到8.9%和6.9%。对CHG和CHH的甲基化有较小的影响。后期的第二项研究并未在转化株中发现5hmC存在的证据。他们认为，5hmC的缺失或许与CG甲基化的降低有关，或体内主动移除了5hmC，或通过BER途径对产物进一步氧化。尽管不能更好的解释两项拟南芥研究结果中5hmC水平的差异，但也可能是TET1和TET3催化结构域活性存在差异。因为对人TET3亚型的研究可知，它们具有不同的表达和底物结合模式。 第二研究小组在植物中表达人TET结构域的研究者运用拟南芥ubiquitin10启动子介导人TET1催化结构域（TETcd）融合人造锌指结构（ZF）的融合蛋白的表达，该融合表达的人造锌指结构用于靶向结合拟南芥FWA基因的启动子。FWA基因启动子中胞嘧啶甲基化的缺失可以引起植物可遗传性开花晚的表型，该表型在TET1转基因株中同样观察到。该研究者同样构建了ZF-TETcd融合蛋白，靶向作用CACT1转座子甲基化基因域，同样进行了靶向去甲基化。此外，他们还开发了一种基于CRISPR/ dcas9的靶向去甲基化。 第三研究小组构建了一种质粒，该质粒将催化失活的SpCas9与人TET3cd（850-1795氨基酸）连接。他们使用了这个质粒的衍生物和四个引导RNA来靶向甘蓝的一个特定基因，该基因在小孢子衍生的双单倍体后代中显示高甲基化修饰。转基因后他们的甲基化水平显著降低，表达显著升高。 基于上述TET的分子工具，制造感兴趣基因的新的等位基因变为可能，同时对于沉默基因的再激活表达、转基因或转座也变为了可能。 综上所述，这四项研究明确表明，人TET催化结构域在植物中表达后具有酶活性，它们可通过氧化5mC产生其它表观遗传标记，并产生稳定可遗传的表型变异。 7、如何在植物中鉴别TET同系物 如上所述，目前在植物中缺乏tet类似酶活功能的证据，那如何更好地探索这方面的证据应该进行很好的分析。目前存在多种观点陈述如下。首先，所有具有已知或未知底物的植物2-OG加氧酶都可以在异源系统中过表达、纯化，然后运用最新的，高分辨率的分析方法和生物信息学方法，对合成的一系列具有不同5mC修饰背景的DNA和RNA进行检测，以发现已知的5mC衍生物。其次，在拟南芥或存在任何所有已知2-OG加氧酶突变的其它植物中，开展类似地发现5mC衍生物的研究。在这种情况下，有必要进行精细的单细胞或其他微量检测技术，考虑到TET类似基因可能像在人和其他后生动物（如果蝇）一样，仅限于在某些特定细胞类型中表达。 对tet类似酶研究提出的第二个问题是，这些酶的氧化功能是否受到进化上不相关的酶的影响。这些酶定义为非同源（类似）、同工异构蛋白质的范畴。换句话说，理论上5mC及其衍生物的氧化可能由2-OG氧化酶以外的氧化酶完成的。 8、总结 尽管上面概述了大量的实验证据，关于植物中Tet类似蛋白生物学功能的几个重要问题仍然没有解决。植物中是否存在TET类似物?在植物5mC氧化过程中，双加氧酶蛋白在多大程度上具有与TETs相似的保守结构域?这个争议将科学家划分为两个主要群体。第一组认为植物中不存在5hmC及衍生物，特别是拟南芥。第二组认为存在5mC衍生物，该衍生物是由酶活去甲基化产生，其过程与哺乳动物途径类似。期待越来越复杂的分析和分子技术能够解决这个重要的问题。 参考文献：doi:10.3934/genet.2019.4.70  编辑切换为居中 编辑切换为居中 |
|
|
