NGS应用探究｜病原微生物

高通量测序（以下简称NGS）技术是继Sanger测序后的一项革命性进步，能够同时对几十万到几百万条DNA进行测序，可实现在较低成本下对多基因、全外显子，甚至全基因组进行多种变异类型检测，且所需样本量和检测周期不会增加^[1]。目前，NGS技术已广泛应用于肿瘤基因诊断、遗传病诊断和病原微生物诊断等领域。

由病原微生物引起的感染性疾病是全球死亡率和发病率最高的疾病之一。随着新冠病毒的爆发，如何快速准确检测病原微生物已成为传染性疾病早期诊断、精准用药和预后评估的首要问题。常规的院内检测主要依赖于微生物培养、形态学鉴定、生理生化特征分析及血清法免疫应答。这些方法均存在检测周期长、操作复杂、灵敏度及特异度受限等问题。而荧光定量PCR技术虽解决了上述问题，仍存在对未知病原微生物无法检出、通量低等问题。

随着测序成本的不断降低，NGS技术因其通量高、整体周期短、可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，可更好的应用于以下场景^[2]：

·  病原微生物分类及快速鉴定 

·  传染病监测

·  病原微生物耐药性研究

NGS 在病原微生物中检测主要采用两种方案，即rRNA基因测序和宏基因组测序。rRNA 基因测序在临床上常用于细菌（16s rRNA）、真菌（18s rRNA）的鉴定，同时也是菌群分析的基础。而宏基因组与rRNA基因测序相比，可获取的信息更加全面，更适合用于复杂临床标本中的病原微生物鉴定^[3]。

NGS应用于病原微生物的两种方案

rRNA基因测序

16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，包括 10 个保守区域和 9 个高变区域，对高变区核酸序列进行NGS测序, 可区分种或属特性，被认为是适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。16S扩增子测序通常是选择某个或某几个变异区域，利用保守区设计通用引物进行文库扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定，16S rDNA扩增子测序技术已成为研究样品中微生物群落组成结构的重要手段^[4-6]。

16S rDNA基因区域

GENETRON S5相比于其他测序平台，可实现单端600bp测序，无需overlap拼接，更适合于16S扩增子测序分析，为微生物多样性研究提供更多选择。

GENETRON S5 适用16s扩增子测序的芯片规格

宏基因组

宏基因组测序（mNGS）通过NGS技术直接从临床样本中获取全部的核酸（DNA和RNA）序列，进一步与各个物种（病毒、细菌、真菌等）的基因组序列比对，从而得知样本中所含微生物种类和比例的检测技术。与16s等扩增子测序技术相比，mNGS可以获得更多微生物群落功能方面的信息，测序结果不仅包含了群落的多样性信息还包含了功能的信息，这为研究微生物群落中单个物种、物种与物种的相互作用以及物种与环境之间的相互作用提供了信息。目前，该技术已纳入的病原体有8000多种，其中包括4000多种病毒、3000多种细菌、200多种真菌等，为罕见病原微生物感染提供快速、有效的诊疗手段^[7]。

宏基因组工作流程及面临的挑战

针对宏基因组和16S 扩增子技术在病原微生物检测中应用的实例，小编将用 2 期文章带领大家继续深度探究～

参考文献

[1] Erwin L. van D., et al. (2014). ' Ten years of next-generation sequencing technology' .Trends in Genetics. 30 (9) :418-426

[2] Ruud H. D., et al. (2017). ' Application of next generation sequencing in clinical microbiology and infection prevention ' .Journal of Biotechnology. 243:16-24

[3] Stefan A. Boers., et al. (2019). ' Understanding and overcoming the pitfalls and biases of next-generation sequencing (NGS) methods for use in the routine clinical microbiological diagnostic laboratory ' .Eur J Clin Microbiol Infect Dis .38 (6) :1059-1070

[4] Caporaso J. Gregory., et al. (2011) ' Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample' .Proceedings of the National Academy of Sciences 108.Supplement 1 : 4516-4522.

[5] Youssef Noha., et al. (2009) ' Comparison of species richness estimates obtained using nearly complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys '. Applied and environmental microbiology. 75(16): 5227-5236.

[6] Hess Matthias., et al. (2011). ' Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen'. Science 331: 463-467.

[7] Charles Y. Chiu ., et al. (2019). ' Clinical metagenomics '. Nat Rev Genet. 20(6):341-355

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