核质分离检测LncRNA/circRNA的亚细胞定位后续

GT8085 2022-04-21

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核质分离实验注意事项：

1、核质一定要分离干净，吸取胞浆上清的时候一定不要吸到沉淀，同样地，对于沉淀，要完全吸尽残余的上清（吸到沉淀无影响）。

2、无论什么方法分离必定有损耗，所以不用纠结。

3、RT-PCR加样时务必保证加入了等量的胞浆RNA和胞核RNA，这样才能使用简化公式。

4、使用最优引物保证在较大浓度范围内扩增效率接近100%，否则不能使用简化公式。

结果分析方法（简化公式）：

核%=2^-胞核CT值/（2^-胞浆CT值+2^-胞核CT值）

质%=1-核%

公式原理：本人称之为假定内参法

假设有基因Z，基因Z在胞浆和胞核中各占比50%，同时取1000ng胞浆RNA和胞核RNA进行逆转录得到cDNA，在用此cDNA进行PCR（不稀释或者稀释同等倍数），那么PCR得到胞浆RNA和胞核RNA的基因Z的CT值必定一样（显而易见么，加样时基因Z的模板量一样，其他条件相同），我假设CT值都是15，而GAPDH的CT值，胞浆14，胞核16，那么以胞核GAPDH的相对表达量为1，胞浆GAPDH的相对表达量用2^-ΔΔCT 计算就是4，最终得到GAPDH的质%为80%，核%为20%。

同样的，以目标基因Y在胞核的相对表达量为1，目标基因Y在胞浆的相对表达量计算结果就是

2^-(胞浆CT值-胞核CT值)= $%5Cfrac%7B2%5E-%E8%83%9E%E6%B5%86CT%E5%80%BC%7D%7B2%5E-%E8%83%9E%E6%A0%B8CT%E5%80%BC%7D%20$ ，

核%= $%5Cfrac%7B1%7D%7B1%2B%5Cfrac%7B2%5E-%E8%83%9E%E6%B5%86CT%E5%80%BC%7D%7B2%5E-%E8%83%9E%E6%A0%B8CT%E5%80%BC%7D%20%7D%20$ = $%5Cfrac%7B%202%5E-%E8%83%9E%E6%A0%B8CT%E5%80%BC%7D%7B2%5E-%E8%83%9E%E6%B5%86CT%E5%80%BC%2B2%5E-%E8%83%9E%E6%A0%B8CT%E5%80%BC%7D%20$