【原】【LorMe周刊】基因突变与ARGs的互作驱动耐药性进化

LorMe青年 2022-04-30 发布于江苏

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作者：方婷婷，南京农业大学硕士在读，研究方向为土壤生物复合污染与调控

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊介绍染色体耐药突变和抗生素耐药基因之间的特定上位性相互作用。原文于2020年发表在《Nature Communications》上。

导读

细菌可通过染色体突变或抗生素耐药基因（ARGs）的水平转移获得耐药性。那么，染色体突变与ARGs之间是否存在相互作用？二者的互作对细菌耐药性进化产生怎样的影响？为回答这个问题，丹麦技术大学Sommer等开发了一种多重表型分析方法，研究了染色体突变与ARG组合对大肠杆菌抗生素抗性的影响。研究发现，12%的突变与ARGs组合改变了大肠杆菌的耐药性：有的组合具有相同的抗性机制从而表现出强强联合的效应，而有的组合由于抗性寄主不同表现出优势互补。结果表明，染色体突变与ARGs之间存在相互作用，并且这种相互作用是驱动细菌耐药性进化的动力之一。

突变体-ARG 相互作用促进突变体选择

为了探究染色体抗性突变体（以下简称突变体）和抗生素抗性基因（ARGs）之间的相互作用，作者研究了大肠杆菌中121个突变体-ARG组合（11株突变体*11种ARGs）和 23种背景菌株WT和空载体对照在不同浓度（11种）下的不同抗生素（8种）的适应性（图1），通过对突变体-ARG库的表型基因组区域进行测序，量化每个突变体-ARG组合的相对丰度，探究抗生素选择条件下（包括不加抗生素）每种突变体-ARG组合的适应性（图2）。研究结果发现，在无抗生素时， ARGs的引入不会改变突变体相对丰度，这表明耐药基因不会给细菌带来适应性代价或带来的适应性代价很低。在添加抗生素的处理中，部分因引入特定的ARGs而显著改变了突变体丰度分布，大多数突变体-ARG组合在选择培养条件下不会相互影响。当抗生素含量以及抗生素最低抑菌浓度MIC高于药物使用量时，部分突变株相对丰度较高，可能是这些突变体对抗生素产生了耐受性，少数突变体不仅适应受试抗生素，也对另一种抗生素产生交叉耐药性。如图2所示，红色框显示存在对受试药物产生耐药性的ARGs时，携带该耐药基因的突变体在该受试药物培养基中的丰度显著低于其他药物培养基，表明此时ARGs主导了突变体的耐药；蓝色框显示存在对受试抗生素不产生耐药性的ARGs时，突变株的丰度较其他药物培养基略有降低，表明突变体和ARGs之间存在负相互作用，即负上位性；黄色框显示存在对受试抗生素产生耐药性的ARG时，突变体在该受试药物选择下的丰度显著高于其他药物培养基，表明该情况下突变体主导耐药表型。

综上所述，虽然大多数抗性突变体和ARGs之间没有显著影响，但产生了相互作用。

图1 121个突变体-ARG组合以及23个背景菌株WT和空载体对照在8种不同浓度药物的条件下的测序。

图2 突变体和ARG在抗生素影响下的选择性。其浓度为野生型MIC的2倍。

ARG往往在其抗性范围内主导突变体表型

在初步结果表明，多数情况下ARGs主导了突变体的耐药表型，突变体的选择在很大程度上取决于ARGs在抗生素条件下的耐药性和无抗生素条件下的适应性（图2）。为了进一步探究这一现象，作者分别探究了在不同浓度的头孢吡肟、氯霉素和环丙沙星下以及 bla_TEM-219、floR和qnrS1抗生素抗性基因存在与否时突变体的选择模式。结果显示，无抗生素时，从三种不同药物浓度下观察到的选择模式，缺乏给定ARGs时，突变体丰度较高，但不同浓度突变体丰度有一定的变化（图3）。这种浓度依赖于突变体选择模式，与在无抗生素存在时每个突变体需要的适应成本以及各自的抗生素耐药性特征很好地对应。

当突变体携带bla_TEM-219或floR抗性基因时，抗性基因的存在显著增强了突变体抗性，导致其主要基于其适应性而非在亚药物浓度下对抗生素的抗性水平来选择突变体。在抗生素浓度略高于MIC的情况下，适应LB、CIP和TMP的突变体丰度仍较高。高药物浓度下，ARGs赋予的耐药水平临近阈值时，耐药基因和突变体共同贡献了耐药性，且突变体和ARGs产生了加性效应。比如当头孢吡肟或氯霉素浓度远高于MIC时，抗头孢吡肟或氯霉素的突变体丰度大大提高（图3a，b）。突变体携带qnrS1环丙沙星耐药基因时，会产生由gyrA染色体突变体主导的加性效应（图3c）。

结果表明，突变体适应性和ARGs的耐药能力是决定在特定浓度下选择哪种抗性模式的主要因素，并决定了何时发生加性效应。

图3 有或没有ARGs屏蔽的浓度依赖性突变体选择。对在不同浓度头孢吡肟或氯霉素下表达Tem-219β半乳糖酶（a）或FloR外排泵（b）的突变库进行测序，以确定突变选择模式。c.与gyrA突变相比，qnrS1具有低抗性时突变的选择。

TetA的上位性和nuo功能基因的突变

作者在混合竞争验证试验中，发现在丁胺卡那霉素中观察到两种不相关耐药机制的强负上位性。当tetA基因存在时，降低了丁胺卡那霉素突变体在丁胺卡那霉素中的丰度（图2）。为了确定导致tetA诱导的氨基糖苷敏感性的突变原因，作者利用多重自动基因组工程（MAGE）技术，在存在tetA基因的情况下，将丁胺卡那霉素抗性突变体（Amk3突变体、Amk4突变体）的所有单个突变同时逆转为其各自的WT序列。Amk3突变体（fusA、nuoH点突变）和Amk4突变体（nuoF、fusA点突变）通常与对氨基糖苷类药物的耐药性有关。在一个MAGE循环后，通过对nuo基因的四个存活菌落的靶基因座进行测序显示，发现丁胺卡那霉素存在的情况下，nuo基因突变与tetA发生拮抗作用。在亚MIC浓度的氨基糖苷类中突变体生长量降低，当存在tetA时，链霉素尤其明显（图4a）。这表明nuo途径中的几个基因突变与tetA存在负上位性相互作用。作者同时进行两两竞争适应性实验进一步验证了携带tetA的nuoF和fusA突变体与携带tetA的突变体(具有相同的fusA背景，但nuoF等位基因恢复为WT)在敏感表型中的作用。当链霉素浓度高于4μg/ml时，nuoF突变体表现出明显的竞争劣势，在32μg/ml时被完全抑制（图4b）。

综上所述，tetA的存在以PMF依赖的方式改变了氨基糖苷类抗性突变体（携带的nuo操纵子突变）的抗性水平，并且这种相互作用可能会限制它们在天然大肠杆菌分离物中的共同选择。

图4 TetA诱导对氨基糖苷类药物的nuoF依赖性敏感性。a.在亚MIC浓度链霉素的培养基和不添加链霉素的培养基中Amk4突变体的生长情况。b.在不同浓度的四环素和链霉素下，nuoF突变体与其祖先菌株竞争的适应性。

结论

本文作者利用多重表型分析方法，在多种条件下评估了多个突变体-ARG组合间的相互作用，结果表明 ARGs和染色体抗性突变之间存在不同相互作用，ARGs和染色体突变体之间存在负上位性，这可能会影响细菌抗生素耐性的演变。大多数ARGs都会产生高水平的耐药性，这意味着当ARGs存在时，染色体突变往往是多余的。但是研究ARGs和染色体耐药性突变之间的相互作用将进一步提高我们理解、预测和阻控细菌抗生素耐药性进化的能力，应该寻求在更广泛的基因组背景下以及临床相关的环境中理解细菌抗生素耐药性。