一种高通量检测探针及其熔解曲线检测方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，特别是一种高通量检测探针及其熔解曲线检测方法及其应用。 背景技术[0002]目前，荧光PCR技术已经广泛应用于遗传变异、肿瘤突变和微生物的检测。探针熔解曲线技术又称为后PCR技术，利用能与靶核酸序列特异性结合的检测探针，在扩增程序后加上一个熔解程序，通过逐渐提高温度，使荧光标记探针与靶核酸形成的双链发生熔解，形成一个具有特定熔点(Tm值)的熔解峰，根据熔点的不同可对多个靶核酸进行区分。分子信标探针是熔解曲线常用的一种，其他的还有线性双标记探针、单标记探针、非标计探针等。分子信标探针由茎区域和环区域组成，环区域是与靶核酸特异结合区，茎区域为人为添加的高GC序列，无靶核酸存在时，因其具有发卡结构的形式，荧光基团与淬灭基团相互接触，荧光本底很低，特异性好。分子信标探针虽然优势突出，但是其检测通量较低，灵敏度不高，而且当两个靶标序列的熔点小于4时，很容易形成融合峰，无法判断具体是哪一种靶核酸；市场需要一种各熔解峰均能独立存在，不产生融合，区分效果佳的熔解曲线检测方法，本发明解决这样的问题。 发明内容[0003]为解决现有技术的不足，本发明的目的在于本发明提供了一种高通量检测探针及其熔解曲线检测方法及其应用，本发明的检测探针的熔解曲线检测方法能够达到高通量检测，单个通道就可以同时检测8个及以上的靶核酸，形成特定Tm值的熔解峰，各个靶核酸的熔解峰之间相差2至6℃，各熔解峰均能独立存在，不产生融合，区分效果佳。 [0004]为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案： [0005]一种高通量检测探针，检测探针的5’端标记荧光标记物，3’端进行封闭；3’端具有靶特异结合序列Ⅰ，5’端具有尾巴序列；尾巴序列包括：前3‑5个为GC序列，GC序列后是靶特异结合序列Ⅱ，靶特异结合序列Ⅱ的长度为8‑25nt，Tm值为45‑55℃；靶特异结合序列Ⅱ与扩增子下游的一段序列一致，扩增子下游序列位于检测探针与下游引物之间； [0006]靶特异结合序列Ⅰ在第一轮扩增时与靶核酸结合，靶特异结合序列Ⅱ在第一轮扩增时被酶切，形成第二轮延伸的引物。 [0007]一种高通量检测探针的熔解曲线检测方法，包括如下内容： [0008]设计高通量检测探针， [0009]5’端标记荧光标记物，3’端进行封闭；3’端具有靶特异结合序列Ⅰ，5’端具有尾巴序列；尾巴序列包括：前3‑5个为GC序列，GC序列后是靶特异结合序列Ⅱ，靶特异结合序列Ⅱ的长度为8‑25nt，Tm值为45‑55℃；靶特异结合序列Ⅱ与扩增子下游的一段序列一致，扩增子下游序列位于检测探针与下游引物之间； [0010]进行第一轮扩增， [0011]5’端尾巴序列的靶特异结合序列Ⅱ在第一轮扩增时被酶切，3’端暴露出羟基，可作为第二轮延伸的引物，下游引物的5’端引入GC序列和4至6个C碱基； [0012]进行第二轮扩增， [0013]在第二轮延伸结束之后，探针形成类似发卡结构的分子信标探针，分子信标的茎区域由探针尾巴序列中的GC序列和下游引物5’的GC序列的互补序列组成，探针的3’端被加入4‑6个G碱基，对探针的荧光标记物起到淬灭作用； [0014]探针与靶核酸下游序列匹配、发生熔解，形成特定Tm值的熔解峰，根据探针的5’尾巴序列的碱基组成或与扩增子下游区域的延伸长度设计使得各个靶核酸的熔解峰之间相差2至6℃； [0015]合成检测对象的质粒模板，经过PCR，上机检测。 [0016]前述的一种高通量检测探针的熔解曲线检测方法，根据探针的5’尾巴序列的碱基组成调节熔解峰Tm值的具体方法为：调整探针5’尾巴序列的GC含量，具体通过选择合适的靶特异结合序列Ⅱ在第一轮扩增子上的结合区，结合区的GC含量越高，Tm值越高。 [0017]前述的一种高通量检测探针的熔解曲线检测方法，根据扩增子下游区域的延伸长度调节熔解峰Tm值的具体方法为：探针的靶特异结合序列Ⅱ与第一轮扩增子下游区域的延伸产物长度越长，Tm值越高。 [0018]前述的一种高通量检测探针的熔解曲线检测方法，采用多色荧光标记，利用多通道检测，每个通道检测至少8个靶核酸。 [0019]前述的一种高通量检测探针的熔解曲线检测方法，检测探针的5’端标记的荧光标记物包括：FAM、HEX、ROX、Cy5。 [0020]前述的一种高通量检测探针的熔解曲线检测方法，检测探针的3’端标记的淬灭基团包括：BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB。 [0021]一种高通量检测探针的应用，用于检测多个靶序列突变。 [0022]前述的一种高通量检测探针的应用，检测人乳头瘤病毒靶核酸的方法包括如下内容： [0023]人乳头瘤病毒的8种高危型靶序列包括：HPV16、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV66； [0024]使用通用引物HPV‑F和HPV‑R进行扩增，序列如SEQ NO.01、SEQ NO.02； [0025]在8种高危HPV型的保守区设计检测探针，序列如SEQ NO.03、SEQ NO.04、SEQ NO.05、SEQ NO.06、SEQ NO.07、SEQ NO.08、SEQ NO.09、SEQ NO.10，荧光基团标记在5’端，探针的5’端尾巴序列包含GC序列和一段与扩增子下游一致的序列，GC序列作为分子信标的一个茎，与扩增子下游一致的序列在第一轮扩增时被Taq DNA聚合酶切掉，作为第二轮延伸的引物进行延伸，下游引物的5’端引入GC序列和4至6个C碱基，GC序列在第二轮延伸后得到互补的GC序列，作为分子信标的另外一个茎，4至6个C碱基可在上游引物延伸时在其3’端添加4至6个G碱基，在第二轮延伸之后，检测探针形成类似发卡结构的分子信标探针； [0026]分子信标探针利用多个G碱基对探针的荧光进行淬灭，在后续的熔解程序中，分子信标探针与扩增子发生熔解，形成特定Tm值的熔解峰，根据探针的5’尾巴序列的碱基组成或与扩增子下游区域的延伸长度设计使得各个靶核酸的熔解峰之间相差2至6℃； [0027]人工合成以上8种HPV型别的质粒模板，经过PCR，上机检测。 [0028]本发明的有益之处在于： [0029]本发明检测探针通过探针5’端尾巴序列引入分子信标探针的一个茎，同时通过下游引物5’端GC序列再引入分子信标另一个茎和4‑6个游离的G碱基，4‑6个游离的G碱基能发挥良好的淬灭作用； [0030]根据探针的5’尾巴序列的碱基组成和与扩增子下游序列的延伸长度来调节Tm值，同时探针可使用多色荧光基团标记，利用多通道从而达到更高通量的检测目的，单个通道可以检测8个及以上的靶核酸； [0031]本发明使用的检测探针，在第一轮扩增时，其靶序列特异性结合序列Ⅰ与靶核酸特异结合，此时靶序列特异性结合序列Ⅱ被酶切，形成第二轮延伸的引物，通过两次特异性结合，增强了检测特异性，形成更窄的熔解峰，提高了通道利用效率，也同时提高了检测灵敏度。 |
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