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摘要 随着曲美替尼等上市药物的出现，激酶的变构抑制已被证明与正构抑制具有类似的药理作用和临床效果。然而，20多年以来，FDA批准的变构抑制剂涉及的激酶靶点数量非常有限，这表明其发现和验证都存在一定挑战。最近，Midwest制药的Mader博士及Relay Therapeutics的Pan Yue博士综述了变构抑制剂的分类和理论，总结了MEK1/2和BCR-ABL1变构抑制剂的研发过程，并讨论了主要的变构配体筛选方式。 作者 | 小苏子叶 2001年伊马替尼的获批激发了人们对激酶抑制领域的探究兴趣，变构抑制是其中一个重点方向。目前临床已有70多个小分子蛋白和脂激酶抑制剂获批(图1)，但变构抑制剂的数量和涉及的靶点都较少, 仅包括4种III型MEK1/2抑制剂以及1种IV型BCR-ABL1抑制剂(asciminib)。 图1. FDA批准的小分子蛋白和脂激酶抑制剂，截至2021.10.29(深蓝-III型抑制剂/浅绿-IV型抑制剂/浅蓝-共价抑制剂/白色-I型和II型抑制剂)为什么获批的数量不多？因为变构抑制剂的开发面临诸多挑战。在筛选变构配体时，必须考虑蛋白质的动态性质，与诱导口袋结合的动力学，以及化合物库选择、筛选模型开发和功能活性测试等其他工作。 变构抑制剂在选择性方面往往有突出优势，具有较好的耐受性和体内药理学表现。因此，即便面临多重挑战，对变构抑制剂的开发仍然受到持续关注。 
表1. 各类型激酶抑制剂及其特征 I型抑制剂靶向激活状态下激酶的ATP结合位点，II型抑制剂则与“非活性构象”的激酶结合。它们都是正构抑制剂，在目前FDA批准的蛋白和脂激酶抑制剂中占比约80%。III型抑制剂作用于ATP结合位点的近端或紧邻区域，结合后会改变α-螺旋的位置，形成酶的“非活性构象”，往往表现出ATP非竞争动力学。MEK1/2抑制剂曲美替尼、考比替尼、贝美替尼和司美替尼是典型代表。 IV型抑制剂作用于远离ATP结合位点的区域。虽然西罗莫司等mTOR抑制剂也归类于其中，但它们并非直接作用于mTOR结合口袋。Asciminib是一个真正的IV型抑制剂。III型和IV型抑制剂均属于变构抑制剂。V型抑制剂跨越了激酶的两个区域，目前尚无临床药物。VI型抑制剂TYK2等激酶具有非催化的ATP结合口袋，即假激酶结构域，也可以认为是变构位点，针对该位点的抑制剂属于VI型抑制剂。(对于I型和II型抑制剂，星号代表正构位点；对于III型、IV型和VI型抑制剂，红色填充模型代表ATP，星号代表变构位点) 最初的MWC模型和KNF模型认为，蛋白质在构象间的运动是“协同”或“序贯”的。现在，“群体流动”模型被更多人接受，该理论认为每个蛋白和蛋白群体内的构象分布是动态的，变构调节剂与最互补的变构位点结合后，大量蛋白的其他构象向可结合调节分子的构象群体流动，将构象重新分布到对变构调节剂有利的状态。III型抑制剂与激酶结合时，α-C-螺旋和谷氨酸残基的移动会使激酶具有非活性构象；IV型抑制剂占据结合口袋后，则通过残基共振传递至蛋白质活性位点，导致催化活性下降。 诺华的研究显示，截至2015年10月，有10种激酶具有III型口袋，包括：ITK、MEK1/2(DFG-in)、AKT、FAK、IGF1R、LIMK、PAK1、RIPK1和p38α(DFG-out)。7种激酶具有IV型口袋，其中ABL、AMPKα1/2、CHK1、JNK1和PDK1的配体具有功能活性，另外两个(JAK3和PKACα)为非功能性口袋。图3中所有激酶家族都至少有一个成员具有III型或IV型口袋。
绿点代表经过共晶体结构验证的III型结合位点的激酶 蓝点代表经预测具有III型结合位点的激酶 红点代表同时具有验证和预测的III型结合位点的激酶 
1995年首次发现ATP非竞争型MEK1/2抑制剂1，并在后续筛选中作为工具分子，获得了中等细胞活性的2。考虑到活性的提高可能归因于羧基，采用不同的羧酸电子等排体改造得到3，但3的溶解性较差和代谢较快，导致体内暴露量较低。进一步改造后的分子4溶解性和代谢稳定性明显提高。在4与蛋白的共晶体结构基础上，利用变构口袋中Asp190形成的额外氢键作用，优化获得考比替尼 (6)，异羟肟酸酯片段被替换以提高代谢稳定性。曲美替尼 (5) 的发现源自于对160000个化合物进行的高通量筛选，针对嘧啶酮骨架的hit进行结构优化得到5。
5、6和贝美替尼 (7) 临床上主要与RAF抑制剂联合治疗BRAF V600E或V600K突变的黑色素瘤。最近，III型MEK抑制剂已经实现了治疗儿童1型神经纤维瘤病的临床概念验证，司美替尼 (8) 已获批，mirdametinib (4) 正在进行临床试验。2006年，诺华首次披露的BCR-ABL1变构抑制剂10是从5万个化合物的筛选中获得的hit (11) 优化而来。在10的基础上优化得到12，但12的PK性质不太理想，对新筛选获得的hits进行NMR和X-衍射共晶体结构等研究，优化获得asciminib (9)。这期间，诺华还开始探索将9与正构抑制剂联用，认为对BCR-ABL1的双重抑制可以改善治疗结果，且两个具有不同耐药机制的分子联用较好。体内实验表明，联用能够延迟耐药的发生，具有比任一单药更持久的效果，如在KCL-22小鼠异种移植瘤模型中，9和13的联用取得了最好的临床前疗效，在BCR-ABL1T315I/H396R的Ba/F3小鼠异种移植瘤模型中将9与帕纳替尼联用也有类似的结果。目前，9与正构抑制剂13，14，15联合使用治疗CML的临床试验正在开展中。
激酶变构抑制剂开发的核心优势在于，与正构位点相比，变构位点的残基和构象具有更大的差异，使激酶的选择性更容易实现。正构抑制剂往往具有相似的结构特征，可能对其他激酶也产生抑制，且专利空间小。与正构位点相比，变构位点的残基保守度显著降低。图6和表2展示了15个变构抑制剂的激酶选择性数据，大多数都表现出良好的选择性，脱靶效应极低。本文还调研了文献中报道的所有变构抑制剂hit的获得方式，统计结果如图7所示，涉及17种不同的激酶靶点和20个变构抑制剂。
高通量筛选 (HTS)最为常用。变构位点的同源性较低使其“优势结构”较少，故涵盖多样性化学结构的HTS是合适的发现手段。另外，预计DNA编码化合物库 (DEL) 在不久的将来也可用于变构抑制剂的筛选。表面等离子共振 (SPR)和亲和选择质谱 (ASMS)等生物物理方法。这种方式的通量相对较低。基于片段的筛选 (FBS)可以与SPR、NMR或X-射线晶体等手段结合。总结与展望 在过去的十年内，FDA对激酶变构抑制剂的批准验证了这种结合模式在临床上的有效性。目前仅少数激酶具有变构结合口袋，研究工作主要集中于经过概念验证的激酶。寻找更多的变构口袋需要利用过去20多年获得的经验，并面临结合口袋较浅和瞬时性的挑战。 尽管挑战诸多，机会同样存在。在激酶组内每个亚家族中都有变构口袋报道，变构抑制剂更好的选择性和耐受性，以及与正构抑制剂联用降低耐药突变产生的可能，都为进一步探索该领域提供了强大的动力。随着越来越多筛选方法的建立和完善，如基于酶和细胞的HTS，基于片段的筛选和DEL筛选等，我们已准备好迎接挑战。 1. Pan,Y.; Mader, M. M. Principles of Kinase Allosteric Inhibition and PocketValidation. J. Med. Chem. 2022, 65, 5288−5299.2. Lu, S.;Shen, Q.; Zhang, J.* Allosteric methods and their applications: facilitatingthe discovery of allosteric drugs and the investigation of allostericmechanisms. Acc Chem Res. 2019, 52(2):492-500.3. 《基于结构的药物及其他生物活性分子设计：工具和策略》科学出版社
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