 1 前言 2001年FDA批准伊马替尼上市，成为验证ATP-竞争性、正构结合位点配体作为人类使用的有效药物的关键里程碑。这一药物的成功，引发了对激酶抑制的多个方面的研究，包括了解正构结合位点结合后的微妙变化和选择性作用机制(MOA)，如假激酶、变构和共价结合，以及蛋白质相互作用的破坏。目前已有70多种小分子蛋白和脂激酶抑制剂被批准用于临床(图1 )。
图1. FDA批准的小分子蛋白和脂激酶抑制剂 虽然三个机制 (正构、变构和共价体)在批准的药物中都有代表性，但在核准数量和目标多样性方面，变构作用机制的代表性相对不足，仅包括2013年开始核准的4种III型MEK1/2抑制剂((trametinib, cobimetinib,binimetinib,和selumetinib)和2021年10月批准的IV型BCR-ABL1抑制剂(asciminib)。预计TYK2假激酶抑制剂杜克拉维替尼（deucravacitinib,）将于2022年提交审批。 目前已批准的激酶药物和已证实的变构结合靶点的代表性不足，可能是变构抑制剂发现面临的各种困难的结果。X射线共晶结构中的变构体抑制剂分析突出了蛋白质构象重排的意义和预测变构体位点的难点。因此，筛选策略必须考虑到蛋白质的动力学性质以及与诱导的口袋结合的动力学。在基于细胞的检测中，识别不具有功能活性的配体需要付出巨大的努力，这一流程包括：从确定哪种化合物的集合，到筛选和开发合适的筛选模式，再到确认结合、生化和细胞检测之间的体外实验方案。 2 激酶-配体结合的分类和原理 激酶的配体结合口袋的类型 术语“ATP口袋”和“正构结合位点”常互换使用。一个正构结合位点是内源性配体结合的受体位点，对于激酶，内源性配体则是ATP。蛋白激酶正构配体结合的分类是为了反映蛋白质构象的细微差别，也是为了描述变构配体的结合。最熟悉的正构配体类别是Ⅰ型和Ⅱ型。虽然两者都与ATP竞争，但Ⅰ型配体与酶的一种活性形式结合。激酶的活性构象是α螺旋由催化性的赖氨酸和谷氨酸之间形成盐桥进行定位。（如下图所示）。
Ⅱ型配体与酶的非活性形式结合。由于含有Asp-Phe-Gly ( DFG )基序的柔性N端loop向外或远离活性位点，因此激酶不激活。在此过程中，ATP口袋可以被loop部分阻断，同时也为配体的结合创造了一个新的口袋。描述正构结合位点构象额外细微差别的还有Ⅰ型和Ⅱ型的亚分类，目前FDA批准的蛋白激酶和脂激酶抑制剂中约有80 %归为Ⅰ型或Ⅱ型。 表1. ATP结合位点以及口袋分类
与正构结合位点不同，变构体调节是通过在酶活性部位以外的位点结合配体来实现的。因此，该位点可能位于蛋白质上的任何地方，被描述为Ⅲ型或Ⅳ型。Ⅲ型配体结合在ATP位点附近或紧邻的位置。X射线晶体学显示，配体可以结合到Ⅲ型口袋中，无论是DFG-in (活性)还是DFG-out (非活性)构象。这两种构象的共同之处在于，这种结合可以促使αC螺旋的位置发生改变，使其形成一种不活跃的构象，从而阻止催化所必需的谷氨酸在ATP位点的正确排列。 第Ⅲ类抑制剂倾向于显示ATP非竞争性动力学，要么结合不能有效利用ATP的酶的形式(见下文对构象的讨论)，要么结合酶.底物复合物。然而，单纯的动力学分析不足以证实Ⅲ型结合，还需要进一步的生物物理表征。FDA批准的MEK/2抑制剂曲马替尼、艾司替尼、贝尼替尼和司美替尼是Ⅲ型配体的显著例子。 Ⅳ型配体结合在远离ATP位点的位点上。虽然mTOR抑制剂西罗莫司、依维莫司和替米索罗莫司属于Ⅳ型抑制剂，但需要注意的是，它们首先与FKBP12结合，进而与mTOR结合，导致催化的抑制；Asciminib是一种真正的Ⅳ型配体，它结合在激酶BCR-ABL1的一个位点上，该位点远离正构口袋，通过残基网络调节催化活性。Ⅲ型和'真’Ⅳ型配体都被认为是通过调节一个残基网络通过蛋白质向活性位点 的移动而破坏催化。这种对残基移动的影响也被描述为一种“诱导性网络”。图3示意图描绘了典型激酶BCR-ABL1上结合口袋的位置。  变构调节理论 许多综述总结了变构调控理论的演变。20世纪60年代提出的最初概念认为蛋白质存在于有限数量的离散构象中，构象能够容纳具有互补形状的配体结合。构象之间蛋白质的运动被认为要么是'协调一致’或要么是'依次进行’的。这些模型发展到一个“种群转移”模型，在这个模型中，与构象状态相关的能量景观被理解为向配体-蛋白质复合物所青睐的构象重新分配。该模型隐含的是将蛋白质看作存在于一个构象集合中，而不是简单的结构状态。在Tong和泽利格的分析中，构象状态之间存在较大的流动性，可以认为是应用于激酶的群体移位思想的变种。 虽然Ⅲ型激酶口袋由于配体结合后的α-C-螺旋和催化谷氨酸残基的移动而具有非活性构象，但上述观察和模型并不能解释为什么Ⅳ型激酶口袋的占据会导致催化活性下降。这种现象可通过类似小提琴的模型可加以解释。在这个模型中，不仅存在构象选择，而且在配体结合后残基的振动跨越蛋白质到活性位点，从而影响蛋白质活性状态。这归因于激酶的残基的半刚性体质。Fersht和同事报道了一个调节远离感兴趣位点电荷的例子，他们发现当天冬氨酸残基突变为丝氨酸时，枯草酸水解酶中距离12埃的催化组氨酸残基的pKa变化了0.40个单位( 0.55kcal/mol )。因此，变构体配体结合的影响可以不仅仅改变构象种群，同时还可能改变正构位点。 由此得出的结论是，并不是所有的口袋在影响蛋白质动力学方面的潜力都相等，从而产生功能后果。例如，口袋可以位于蛋白质的表面，但是在基于细胞的检测中，配体结合在浅口袋中可能并不表现出功能活性。 变构口袋的普遍性 最近发表的文章采取几种不同的方法调查了第III类和第IV类口袋的流行情况。第一种是基于实验配体-蛋白质的X -射线共晶结构来了解构象的相似性和结合口袋的普遍性。第二种是通过与配体EAI001的比较，对Ⅲ型口袋进行了前瞻性的鉴定，发现EAI001与参考结构EFGR T790M的Ⅲ型口袋结合。其他识别“热点”或潜在可药口袋的计算方法也有报道，但总体而言，这些方法并不能确保结合到这些口袋中会导致功能性活性变化。 2017年，诺华制药的一个团队对III型和IV型结构的文献和蛋白质数据库进行了检查。在2015年10月收集数据时，发现有10个激酶含有III型口袋，7个激酶含有IV型口袋。研究表明，Ⅲ型或"后囊"型配体与特定的构象以及靠近催化位点有关。Ⅲ型口袋一般以α-C-螺旋位移和相对于具有正构配基的结构表现为DFG-out模体特征。 这些与DFG-out、变构back pocket结合的抑制剂与II型激酶抑制剂区别在于ATP位点被阻断，与催化残基有关的氢键被破坏。含有Ⅲ型口袋的10个激酶包括ITK和MEK1/2 (DFG-in)，AKT、FAK、IGF1R、LIMK、PAK1、RIPK1和p38 α ( DFG-out )。CDK2是一个非典型的例子，其中一个配体8-苯胺-1-萘磺酸盐( ANS )弱结合(37μM)在正构结合位点附近的口袋中，沿着α-C-螺旋而不是DFG基序延伸。 对于具有“典型”Ⅲ型口袋的激酶，移位的α-C-螺旋为配体结合创造了空间，在ATP位点结合剂的存在和缺失下，α-C-螺旋'out’构象明显稳定。这一观察暗示，只有有限数量的激酶才有可能容纳back pocket所必需的α-C-螺旋构象。确定了较少数量的功能特性Ⅳ型粘结剂(ABL、AMPKα1/2、CHK1、JNK1和PDK1)和另外两个非功能口袋( JAK3和PKACα )。图4中的所有激酶家族都至少有一个成员，已经显示它们具有III或IV型口袋。
其中许多Ⅳ型配体是分子量在200 ~ 300 Da之间的片段。也许并不令人意外的是，与这些低分子量配体相关的结合口袋可能被定性为较浅，可能与该靶点的功能活性无关。 Rastelli小组通过比较EGFR T790M突变株与Ⅲ型抑制剂EAI001 ( PDB编号：5D41 )的X线共晶结构，提出了一种鉴定Ⅲ型变构囊的前瞻性方法。他们利用一组与EAI001相互作用的24个残基所定义的变构体位点，探讨是否存在其他具有类似变构体位点构象的激酶结构。然后对残基在ATP结合口袋附近区域具有相似构象的激酶晶体结构进行计算几何相似性匹配。在应用了额外的相似性标准后，发现了20多个激酶，其中一个可以尝试筛选和鉴定Ⅲ型配体。该小组还与已知的、推测的这些激酶的正构抑制剂进行了对接研究，以确定是否有任何抑制剂能在推测的Ⅲ型位点上可以进行实际地匹配。虽然少数激酶( EGFR、Src、HCK、BTK和BRAF )有大量ATP竞争性配体伸入了变构袋，但没有发现这些抑制剂具有纯粹的变构结合模式。作者认为，这提供了通过创造额外的相互作用和提高活性或选择性来修饰已知配体到达Ⅲ型口袋的机会。没有用激酶或抑制剂进行体外研究。 因此，诺华制药和Bonn小组对III型和IV型配基口袋实验数据的调查确定了29种激酶。拉斯泰利团队为识别III型口袋而采取的前瞻性方法发现了25个，几乎没有哪个口袋可以被描述为纯粹的变构口袋。比较这些集合时，有两个值得注意的地方。首先，这两个数据集的重叠程度不大，只有4种激酶有共同之处(EGFR T790M , ABL1 , ITK和 CDK2)。其次，综合结果显示，在所有激酶中，只有不到10 %的激酶可能具有III型的变构袋。但这可能反映了迄今为止感兴趣的实验方法和靶标，以及预测方法在对接确认步骤中使用的口袋约束和配体。理想的情况是，通过不同的筛选方法、配体收集和三分化方案，可以被变构化抑制的激酶池会显著拓宽。 3 案例研究 MEK1/2和BCR-ABL1等变构酶抑制剂的发现历史,说明了寻找变构酶抑制剂和验证其功能活性的挑战和策略，值得深入研究。 Mek1/2型Ⅲ型抑制剂的发现 于1995年被报道的色原烷结构（1） (图5 )是在激酶级联试验中发现的，该试验用于鉴定MAP激酶RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的抑制剂。色原烷细胞活性较差，但它是一种有用的参考化合物，可以进行额外的筛选工作，利用同样的激酶级联实验和细胞实验，测定化合物处理后磷酸化ERK (pERK)的水平，并刺激血小板源性生长因子(PDGF)的激酶通路。
图5. Mek1/2型Ⅲ型抑制剂结构和状态 通过此过程鉴定出邻氨基苯甲酸（2），其细胞活性较低，归因于该羧酸的存在。考察了多种酸电子等排体，包括羟肟酸和羟肟酸酯，导致CI-1040（3）。化合物3通过异种移植模型进行了概念验证，并于2000年进入临床发展。结直肠癌、非小细胞肺癌( NSCLC )、乳腺或胰腺癌的2期研究患者在800 mg BID下连续口服CI-1040，但由于疗效有限，化合物3的发展于2004年终止，其原因是与不溶性和快速代谢相关的低全身暴露。研究小组预料到这些潜在的挑战与化合物3的药理学和药理学性质有关，并发现在两个区域的修饰可以显著提高细胞的效力以及溶解性和代谢稳定性。 首先，用羟乙基羟肟酸类似物取代环丙基甲基，细胞效价提高了10倍。第二，在苯胺环的邻位用氟取代氯，使细胞活性提高了35倍。在强效的同时，溶解度保持较小，用二羟丙基取代羟乙基酯可获得较好的效价和溶解度，增加代谢稳定性。这种化合物PD-0325901现在被称为米达美替尼(4)，目前在实体瘤和儿童低级别胶质瘤中仍在研究中。这些报告引发了许多其他小组开发MEK1/2的Ⅲ型抑制剂 早期的报告显示（3）不是正构配体；因此，这里研究了人MEK1和MEK2与MgATP和（3）类似物的三元复合物的三维结构。复合物表明，抑制剂诱导了几种构象的改变，导致催化失活，并且抑制剂结合在一个新的口袋里，该口袋与ATP位点相邻但分开。这种结构信息并不影响识别曲马替尼(5)的发现。在这种情况下，16万个化合物被用于在高通量支链DNA试剂中诱导p15INK4b mRNA的表达的筛选研究。一个初始有希望的命中具有2，4，7 -三氧嘧啶[4,3-d]嘧啶核，通过优化得到（5）。在优化阿莫替尼(6)的过程中，研究小组在MEK1：AMPPCP复合物中应用了（4）的X射线共晶结构，目的是取代羟肟酸酯，提高代谢稳定性。在变构袋中利用了与Asp190的额外氢键作用。优化最终得到6个，其中3 -羟基-3 - [ (2S)-哌啶-2-基] 氮杂环丁烷酰胺是关键的结构分化。虽然人们可以推断出X射线共晶结构是以结构为基础的方法应用的，但与发现宾尼替尼( 7 )和司美替尼 ( 8 )有关的药物发现和优化策略尚未见报道。MEK抑制剂曲美替尼(5)、厄贝替尼(6)和滨美替尼(7)的临床应用主要是联合RAF抑制剂治疗BRAF V600E或V600K突变的黑色素瘤。联合作用的机制与MEK1/2的变构体作用机制无关，这是因为抑制MEK可通过ERK引起BRAF的反常激活。最近，Ⅲ型MEK抑制剂取得了治疗儿童1型神经纤维瘤病概念的临床证明，促进了司美替尼(8)的批准和正在进行的成人米达美替尼(4)临床试验的开展。 IV型BCR-ABL1抑制剂的发现 化合物ABL001/asciminib (9)是Ⅳ型抑制剂的典型例子，相关结构如图6所示。诺华制药于2006年首次披露了BCRABL1的一种新的促肾上腺皮质激素抑制剂GNF-2 (10)。该化合物是从50 000个化合物的差异细胞毒性筛选中鉴定出的一个hit,并优化得到。该化合物被分流为更偏好BCRABL1驱动细胞的抑制剂。最初的hit是氨基嘧啶（11）很容易被假设为正构体抑制剂，但其生化和细胞活性的其他方面与正构体结合不一致。这说明（11）可以是在一个替代位点结合，其X射线晶体结构已于2003年发表。在这一假设下，诺华制药的研究小组对这种Ⅳ型口袋的功能活性进行了详尽的表征和验证。所使用的工具包括在豆蔻酰口袋中进行突变，使之与溴化物结合，从细胞提取物中提取靶标，以及与ATP不竞争的动力学特征。 对10优化后得到GNF-5 (12)，为小鼠体内POC提供了支持，但PK属性需要团队确定一个新的起点化合物。对500个可溶性化合物进行核磁共振片段筛选，鉴定新的起始点。早期的研究并不是功能性抑制剂，但核磁共振研究和X射线共晶结构都导致了深入的认识和修改，最终发现了化合物asciminib (9)。然而，ATP竞争的Ⅱ型配体在（12）的存在下仍然可以结合，诺华制药小组探索了一种与尼洛替尼(13)等正构体抑制剂（9）联合给药的双重给药方法。  图6.BCR-ABL1型Ⅳ型和Ⅱ型抑制剂结构 双药策略的核心是假设BCR-ABL1采用不同的靶向机制双重抑制可能通过提供增强的靶点复盖和阻止耐药的产生来改善治疗结果。诺华研究小组断言，阻止抗性的产生可能取决于两个分子具有不重叠的抗性机制。因此，在含有单点突变的Ba/F3细胞中，分别用（9）和尼洛替尼(13)、伊马替尼(14)、达沙替尼(15)等正构抑制剂进行48 h增殖试验，得到耐药谱。这些突变与豆蔻酰位点、SH3/酶结构域界面以及催化位点有关。观察到不同程度的互补性，其中（9）和（14）的互补性最大，而（9）和（13）的特性有些重叠。 随后在体内进行了这些发现的验证探索，（9）和（13）的互补抗性图谱表明，该组合可能延缓抗性，比单独使用任何一种药剂都具有更持久的作用。的确，在KCL-22小鼠异种移植模型中，（9）和（13）同时处理可获得最大的临床前疗效。在表达BCR-ABL1T315I/H396R的Ba/F3细胞的小鼠移植瘤中，（9）与波那替尼联合应用也有类似结果。虽然FDA于2021年底初步批准（9）为单药，但目前正在进行临床试验，探讨（9）与（13-15）等变构抑制剂在慢性粒细胞白血病(CML)中的联合应用。 4 选择性与筛选法方法 选择性 开发变构激酶抑制剂的一个核心概念是，与正构结合位点相比，变构化口袋中的残基和构象具有更大的异质性，使得激酶选择性更容易实现。虽然拉帕替尼、卡马替尼等正构体抑制剂表现出较好的选择性，但正构体抑制剂往往具有相似排列方式的共同结构特征，如与芳香环相连的氢键给体/受体模块与铰链相互作用模拟ATP的结合，增加了命中其他激酶的机会，也使得化合物落入到日益拥挤的专利空间。人们普遍认为，激酶变构位点的同源性较低，即使在同一激酶的变构体内部也是如此，尽管这种定量在文献中很难找到。此外，变构体位点也可以位于不同的结构域上，为进一步挖掘更大的化学多样性提供了机会。例如，变构体CHK1抑制剂（16）(图7)在激酶的C端结构域附近结合，而变构AKT抑制剂（17）则在激酶与普克斯特林同源结构域的界面结合。  图7. CHK1和AKT变构抑制剂 虽然激酶变构抑制剂被认为具有更高的选择性，但是我们没有找到一个全面的数据集来系统地分析和论证这个化合物类的选择性。根据文献报道的激酶选择性数据(图8和表2)，我们合成了15个变构体抑制剂，它们都具有X -射线单晶结构，表明它们结合在一个变构体位点上，生化或细胞活性表明它们具有功能。虽然理想的细胞数据可用来评估一种变构抑制剂的激酶选择性，但使用生化检测工具来衡量脱靶物的活性更为普遍。  图8. 选择性激酶变构抑制剂结构
尽管存在潜在的发表偏倚，因为非选择性激酶抑制剂不太可能被披露，但大多数此类化合物显示出极小的脱靶激酶活性。例如，TrkA抑制剂（18），是Ⅲ型类化合物具有优良的选择性。由于ATP结合位点氨基酸残基相同，Ⅰ型和Ⅱ型TrkA抑制剂对TrkB和C缺乏选择性。TrkA抑制剂（18）通过结合在激活环和并膜结构域形成的位点上，利用3种亚型之间的差异，（18）对TrkB(180倍)和TrkC (70倍)具有选择性。它对广泛的激酶谱和Cerep脱靶谱也有选择性，在10μM时没有明显的抑制作用(>40%)。 另一个结构独特的TrkA抑制剂，（19）也显示出高超的选择性。有趣的是，为MEK (5、6和 8)开发的几种结构多样的Ⅲ型抑制剂都具有优良的选择性，这表明了变构体口袋提供的内在选择性， 表2中，并非所有的变构抑制剂都具有高选择性，如ERK5抑制剂（20）和FAK抑制剂（21）所示。这两种化合物都有针对其靶点的微摩尔亲和力，很可能只是早期的先导物。化合物（20）仍然比两个正构体抑制剂抑制更少的脱靶，而在（21）中吡唑NH中加入一个乙基基团，破坏与激酶结合的潜在铰链，显著提高了其选择性。Bajorath等人还对激酶的诱导性位点进行了详细的分析，并确定了潜在的交叉活性，例如c-ABL和CDK2共享的类似的结合位点，可以帮助确定选择性分析的脱靶位点。 除激酶外，变构激酶抑制剂仍可能对GPCRs和离子通道等其他类蛋白具有脱靶活性。例如基于二苯并地平支架的某些PAK1抑制剂也能抑制组胺受体H1和毒蕈碱受体M1。通过优化，这种脱靶效应可被消除。 筛选方法 除了选择性之外，这里还调查了所有文献报道的烯丙基激酶抑制剂的命中生成方法。在大多数情况下，除非两种不同的方法独立使用，否则只包括第一个针对每个激酶靶点的变构抑制剂的发现。这是因为一旦确定了"first-in-class"的变构体抑制剂及其结合位点，其他方法如放射配体位移筛选、支架变形、基于结构的设计等都能产生更多的优化线索。我们的数据集包含17个独特的激酶，各种命中生成方法如图9所示。高通量筛选( HTS )是目前最流行的方法，常采用生化或细胞检测方法进行。筛选中使用的库规模跨度很大，从几千到250万不等。例如，在生化检测中发现EGFR双突变体L858R/T790M的一个变构构体抑制剂的筛子检测到~250万个化合物，随后用较高浓度的ATP和野生型EGFR进行反筛，分别去除ATP位点结合子和非选择性抑制剂 由于医药行业通常将HTS作为主要的命中查找方法，HTS占命中率65 %的原因可能有历史渊源。值得注意的是，与正构结合位点相比，变构体口袋具有较低的序列同源性，因此可以提供选择性，这是因为在变构体抑制剂中，可以被认为是"特权"的化学类型较少。因此，涵盖大化学多样性的HTS实际上是寻找变构体撞击的必要和理想的方法。尽管目前尚未见由DNA编码库( DEL )筛选产生的变构激酶抑制剂的报道，但DEL已成为一种重要的命中生成途径，我们预计此类病例研究将在不久的将来得到报道。 除了高温超导外，表面等离子体共振( SPR )和亲和选择质谱( ASMS )等生物物物理方法也被用来发现变构抑制剂，尽管它们的通量可能更低。虽然这些筛选方法可以识别与靶蛋白结合的分子，但是击中物是否结合在变构位点或者是否具有功能效应仍需要评估。 由于在文献中常常不清楚哪些生物物理方法被用于基于碎片的筛选(FBS)中，我们将FBS置于另一类别的命中查找方法中，通常可以使用SPR、NMR或X射线结晶学方法进行。在变构体PAK1抑制剂的发现中，通过基于片段的筛选和X-衍射晶体学鉴定，发现了Ⅲ型口袋和dibenzodiazepine药物。为了发现Ⅳ型抑制剂，全长蛋白优先于激酶域。同样，由于构象选择或诱导契合，变构抑制剂可能具有较慢的结合动力学；因此，较长的分析时间可能有助于发现此类化合物。此外，在结合实验中，一个已知的邻位结合剂可以用来阻断ATP位点，从而过滤掉邻位结合子。或者，可以使用计数器筛选或计算机过滤技术可用于替代选项移除变构结合子。  5 讨论：方案流程 率先为这些不同激酶发现Ⅲ型和Ⅳ型q抑制剂的团队所报告的经验表明，即使有良好的筛选策略和大量的化合物收集，验证一个新的口袋，并确认变构结合转化为感兴趣的功能活性，也可能是漫长的旅程。虽然基于细胞的筛选是成功的，但是反卷积输出来确认结合模式可能是耗时的，BCR-ABL1型IV口袋的发现证明了这一点。如果选择HTS方法，那么变构口袋本身的属性可能会增加筛选输出评估的复杂性，特别是在识别IV型口袋时。 首先，对Bonn组设定的激酶晶体学分析表明，虽然可以发现大量的口袋，但其中许多口袋较浅。由此可见，筛选命中可能具有适度的亲和力，在进一步优化之前缺乏功能活性。第二，变构体口袋被证明比正构体位点更亲脂，因此，命中物可能理化性质较差，需要在后续优化中加以解决。由于变构口袋中残基的性质更加多样，相应配体的结构特征也多种多样，缺乏特权的变构抑制剂化学类型需要对命中集进行细致的分类。 在这种情况下，铅的生成流方案必须明确地确认变构体的结合以及解决潜在的中等效力和较差的理化性质的命中点，因为它们是优化的功能活性。详细介绍变构抑制剂筛选的多种方法已超出本综述的范围，但筛选方法应允许从命中集中识别和去除正构结合剂，并进行第二层评价，以确认结合亲和力，确定结合位点(图10)。结合可以通过SPR、ASMS或差示扫描荧光法( DSF )来评价，取决于活性物质的亲和力。生物物物理方法如X射线晶体学、冷冻电子学和核磁共振等可以用来确定配体结合位点
在此阶段，试剂分析可以包括通过动态光散射( DLS )评估化合物聚集的倾向或对酶浓度变化的敏感性。在有代表性的活性物质存在下，对酶动力学进行分析可以达到两个目的。首先是了解配体是ATP竞争性还是非竞争性。第II类配体主要是非竞争性ATP，尽管如上所述有例外。第二种是了解配体的结合率，因为变构体结合可以对应慢结合现象，这就意味着要调整检测条件，比如延长检测时间，以达到真正的平衡。 随着化合物系列的成熟和亲和力的优化，通过生物物物理方法确认结合可从关键路径移至点检，并可在检测漏斗中加入功能生化检测。在先导化合物优化过渡的过程中，功能活性的评估将以细胞为基础，有相关的药效学终点，如激活一个下游激酶，而不是抗增殖活性等表型。相对于一个正构激酶抑制剂项目的流程方案，两个功能测试通常是足够的(即生化和基于细胞的)，不能理所当然地确认一个变构的结合和确定其位置，而变构抑制剂的确认和优化需要评估结合和功能活性。用仔细的生物物物理表征来奠定项目的基础，可以减少或避免后期的返工。 6 展望 近十几年来FDA批准的变构体( 第三类和第四类 )激酶抑制剂验证了这些结合模式的临床可行性。目前有少量的激酶相对于整个激酶组具有Ⅲ型或Ⅳ型口袋，可以理解的是，已经建立在体内的临床前或临床POC的激酶已经成为研究的热点。MEK1/2的Ⅲ型型抑制剂的研发历史表明，当有验证的工具化合物存在时，这些尝试更容易进行。在更多的激酶中寻找Ⅲ型或Ⅳ型口袋将需要利用过去20 多年的经验。挑战包括，口袋可能是较浅的和暂时的，导致实验和计算方法识别它们很困难。因此，确认结合导致一种可取的功能后果可以是一种劳动密集型和耗时的过程。 令人鼓舞的是，在激酶的每个亚家族中都有变构体口袋的报道，并且计算方法表明额外的激酶含有III型口袋，这些口袋仍有待配基。提高了选择性并继续探索基因组学并鉴定这些蛋白。最近几家组织对PI3Kα突变体的变构体抑制剂的研究表明，该领域的兴趣仍然很高。活性强的阿西米尼与同一种激酶的正构抑制剂联合应用的临床前疗效，以及明显减少突变倾向，进一步支持在其他激酶中寻找类似的机会。随着酶学和基于细胞的HTS等广泛的配体发现策略，以及基于片段的和DEL的筛选的出现，人们已经开发出充分的工具包，为相关挑战做好了准备。 参考资料 Pan Y, Mader MM. Principles of Kinase Allosteric Inhibition and Pocket Validation. J Med Chem. 2022 Mar 21. doi: 10.1021/acs.jmedchem.2c00073. |
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