|
自2001年起，已经有76种小分子激酶抑制剂（SMKI）被FDA批准用于癌症和其他疾病的治疗。但SMKI研发仍然面临两个关键挑战：首先，大多数SMKI结合在激酶的保守ATP口袋，因此在人类激酶组中缺乏选择性；其次，使用SMKI一段时间后通常会发生获得性耐药，主要由激酶自身的二级或三级突变（on-target resistance）或下游和旁路激活（off-target resistance）驱动，这也成为靶向抗肿瘤药物临床耐药的主要原因。
2020年，暨南大学药学院陆小云研究团队在药物化学顶级期刊（J. Med. Chem. 2020, 63, 10726−10741）综述了已经上市的激酶药物中克服点突变的药物研发实例，详细总结了药物发生点突变而引起耐药的原因及目前可以克服点突变的药物化学策略（图1）。靶点点突变导致耐药的主要机制包括：（i）引起空间位阻或电性相斥以降低药物结合能力；（ii）增加ATP对ATP结合域的亲和力，使药物更难竞争占据活性位点；（iii）干扰抑制剂和蛋白活性位点之间形成共价键。据文献调研，克服点突变的药物化学策略主要包括：（i）避免与突变残基的空间位阻，减少突变造成的活性损失；（ii）与突变残基相互作用或与活性位点半胱氨酸形成共价键等方式增加抑制剂结合活性。但仍缺乏一种较为通用的药物化学改造策略针对不同激酶的耐药突变情况。
研究团队认为：构象限制的大环策略一方面能通过构象的改变，减少分子与激酶口袋特定耐药突变氨基酸残基产生的空间位阻（如：溶剂前沿残基和守门残基的点突变）。另一方面，由于大部分激酶抑制剂采用“U”型构象结合，通过构象的限制，可以固定其最低能量构象以降低结合时能量的损失。因此，有潜力作为解决激酶抑制剂点突变耐药的常用策略。
 图1. 常见克服激酶突变的药物化学策略（来源：J. Med. Chem.）
构象限制的大环策略用于新一代激酶抑制剂的研究
近期，该团队针对临床已出现耐药的治疗肺癌的主要靶点，如EGFR、c-Met和TRK等，采用构象限制大环化策略获得克服不同点突变耐药的新一代的激酶小分子抑制剂。主要简述如下。
1. c-Met大环抑制剂（Journal of Medicinal Chemistry, 2022, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c00981）自2020年起，高选择性的I型c-Met抑制剂capmatinib、tepotinib、savolitinib相继被获批用于携带MET14外显子跳跃突变的非小细胞肺癌患者。然而，在使用c-Met抑制剂后会出现获得性耐药，主要为I型的Y1230C和D1228V/N/H突变、II型的F1200L和L1195V突变。另一方面，有研究表明：HGF/c-Met信号通路与胃癌的形成发展也密切相关，部分c-Met抑制剂在临床实验中已经被证实对胃癌有一定的治疗效果，但是目前尚无c-Met抑制剂药物获批用于胃癌的治疗。因此，开发新型的c-Met抑制剂是十分有必要的。首先，基于tepotinib和NVP-BVU972与c-Met的晶体结构分析，研究人员首先使用杂化策略，得到先导化合物9b（图2），进一步对哒嗪酮上的苯基（蓝色）进行构效关系探讨，得到具有较强激酶活性与细胞活性的化合物9y (c-Met IC50 = 4.8 nM，Hs746T IC50 = 11.9 nM）。9y与c-Met的晶体结构（图3A）显示其以I型抑制剂的“U型”模式与c-Met结合。
图2. c-Met大环抑制剂D6808的优化过程（来源：J. Med. Chem.）
为进一步提高细胞活性，研究人员进行了系统的构效关系研究：①为改善化合物溶解性，同时考虑到去甲基化是常见的药物代谢途径之一，对伸向溶剂区域的N-甲基吡唑进行优化，通过替换不同的亲水基团得到细胞活性提高的化合物9yj（c-Met IC50 = 5.4 nM, Hs746T IC50 = 9.8 nM）；②9y与c-Met的晶体结构显示-CH2CH2-linker呈现“folded”构象，并且与激酶没有相互作用，当替换为双键、酰胺等并不能维持活性，猜测可能破坏了“folded”构象；为了进一步避免苄位的代谢不稳定性，将其替换为-CF2CH2-，虽然在激酶水平活性保持（c-Met IC50 = 9.9 nM），但细胞活性略有丧失（Hs746T IC50 = 38.5 nM），这说明了-CH2CH2-linker对活性是至关重要的；③晶体显示9y的-CH2CH2-linker二面角为76.3°（图3A），对9y进行二面角扫描分析后发现其在水溶液中存在三种最低能量构象“unfolded-i”、“folded”和“unfolded-ii”（图3B），对应的二面角分别为-70、75、180°，这说明抑制剂与蛋白结合时会发生从“unfolded”到“folded”最低能量构象的转换，因此推测可以使用大环化策略将其固定在“folded”的最低能量构象以降低结合时能量的损失，最终得到的大环化合物14（D6808）对激酶（c-Met IC50 = 2.9 nM）和细胞抑制活性（Hs746T IC50 = 0.7 nM）均得到提高。D6808与c-Met的晶体结构也显示-CH2CH2-linker的二面角为75.1°（图3A），大环策略成功将其固定在“folded”构象，因此活性明显提高。由此验证了大环构象限制的策略。
对活性优异的开环化合物9yj（图3C）与大环化合物D6808（图3D）进行激酶谱测试，显示化合物D6808比开环化合物9yj具有更好的选择性，环合之后降低了对TRK和AXL的抑制活性。D6808在Ba/F3-Tpr-Met细胞中对于常见的II型抑制剂突变也表现强烈的抑制活性（F1200L/M1250T/H1094Y/F1200I/L1195V IC50 = 4.2, 3.2, 1.0, 39.0和33.4 nM），为新型c-Met抑制剂的研究提供新的先导化合物。
（来源：J. Med. Chem.）
图3. A. 化合物9y/ D6808与c-Met的晶体结构叠合。B. 化合物9y在水溶液中的二面角扫描。C. 化合物9yj激酶谱（373种野生型激酶）。D. D6808激酶谱（373种野生型激酶）
2. II型TRK大环抑制剂（Journal of Medicinal Chemistry 2022, 65, 8, 6325-6337）TRK的一代抑制剂larotrectinib和entrectinib在治疗NTRK融合阳性癌症方面取得了显著的临床疗效，但是新出现的获得性耐药成为未满足的临床需求，主要有溶剂前沿（SF）突变TRKAG595R和TRKCG623R，xDFG基序突变TRKAG667C/S和TRKCG696A。因此二代抑制剂selitrectinib和repotrectinib被开发用于第一代TRK抑制剂耐药的治疗。由于，第二代抑制剂均为I型的大环抑制剂，它们对于SF突变展现出较好的效果，但是对xDFG突变却表现出有限的敏感性。一些II型多靶点激酶抑制剂，如cabozantinib、foretinib、altiratinib和 ponatinib在体内外对xDFG突变模型表现出有效性，但对SF突变活性一般，其由于缺乏选择性，导致有限的临床疗效和潜在的毒副作用。
基于此，陆小云研究团队在早期设计的TRK抑制剂5a的基础上优化得到了5b（图4），5b在激酶和细胞水平对TRKA/C和 TRKAG667C均显示纳摩尔抑制活性，但对TRKAG595R抑制活性较弱。对接结果显示5b的3-氨基哌啶伸向溶剂区域，可能会与突变后的Arg产出空间上的立体位阻，由此猜想可以通过大环化的构象限制策略以克服SF突变。在起初合成的大环化合物6a-6d中，6d显示较强的活性（TRKA/ TRKC/ TRKAG667C IC50 = 16.9/ 37.8/ 24.5 nM, Ba/F3-CD74-TRKAG667C IC50 = 20 nM）。但相比于5b，对SF突变活性仍然没有提高（Ba/F3-CD74-TRKAG595R IC50 = 1.45 μM），推测大环分子中的哌啶基团仍然与突变后的Arg623产生位阻。为提高对SF突变（Gly to Arg）的抑制活性，将6d中的氨基哌啶基团替换为更小的甲基乙二胺，设计合成了化合物7a-7c，7b和7c在激酶水平都可以维持强抑制活性，尤其是对TRKAG595R的活性显著提高（7b/ 7c IC50 = 493.7/ 80.6 nM），其中化合物7b在细胞水平也显示出提高的活性（CD74-TRKA/ ETV6-TRKC/ CD74-TRKAG667C/ CD74-TRKAG595R IC50 = 34/ 23/ 6/ 110 nM）。本研究中总计合成了7个大环化合物。
图4. 基于5b的II型大环TRK抑制剂的优化（来源：J. Med. Chem.）
共晶结构显示化合物7b以II型结合模式与TRKA结合（图5A），甲基乙二胺距离Gly595的距离约为5.6 Å，这解释了对SF突变TRKAG595R抑制活性提高的原因。7b在373种野生型激酶中也显示出较好的选择性（图5B），而且7b在不同融合的Ba/F3细胞中对各种xDFG和SF突变显示出很强的抑制活性（图5C，IC50= 1.7 to 55 nM）。据文献检索该类抑制剂是首个高效大环II型激酶抑制剂（目前已报道的大环类激酶抑制剂均为I型抑制剂）。
（来源：J. Med. Chem.）
图5. A. 化合物7b与TRKA的共晶结构。B. 化合物7b激酶谱（373种野生型激酶）。C. 化合物7b对xDFG和SF突变在不同融合的Ba/F3细胞中的抗增殖活性（1, larotrectinib；3, selitrectinib）。
3. EGFR四代大环抑制剂（Journal of Medicinal Chemistry 2022, 65, 9, 6840-6858）EGFR是肺癌治疗的有效靶点之一。目前，已有五个共计三代小分子抑制剂（一代erlotinib、gefitinib；二代afatinib、dacomitinib；三代osimertinib）被FDA批准上市。尽管目前EGFR抑制剂在临床上被广泛使用，但仍不可避免出现耐药。一代与二代抑制剂一方面不能够排除对野生型EGFR的抑制，另一方面在使用后会出现T790M突变，从而增加了EGFR对ATP的亲和力，三代抑制剂有效解决了选择性问题。但是在使用三代抑制剂osimertinib后会出现797位Cys 突变为Ser，使重要的共价作用丧失，导致进一步耐药。因此，迫切需要开发第四代能同时克服T790M与C797S双重耐药突变的EGFR抑制剂。
研究人员通过分析osimertinib和ALK抑制剂brigatinib（报道具有EGFRC797S抑制活性）与EGFR的结合模式，发现osimertinib由于丧失了与Cys797的共价作用而对EGFRC797S突变体活性降低，而brigatinib一方面不依赖与Cys797的共价作用，同时其磷氧基与Lys745的额外氢键相互作用有助于提高对EGFRC797S的活性。因此，同样先采用优势片段杂交策略得到化合物17（图6），其中保留osimertinib中可以实现EGFRT790M选择性的吲哚片段，通过在吲哚氮上引入磺酰基靶向Lys745产生相互作用。对R2，R3基团考察后得到一系列对突变体选择性及激酶活性良好的化合物17g（图7），但是这些化合物由于T790M突变体显著增加的与ATP的亲和力，对Ba/F3 EGFRLR/TM/CS细胞表现不佳，需要进一步的改造以提高化合物的结合能力。
图6. 使用杂化策略得到新型EGFRC797S抑制剂（来源：J. Med. Chem.）
化合物17g与EGFRT790M/C797S的晶体结构显示其嘧啶母核与吲哚基团间的二面角为−30.9°，呈现“unflipped”构象（图7B）。利用量子化学的方法对其二面角进行扫描（图7D），显示其存在三种最低能量构象，其中包括两种“flipped”构象，这说明分子在与EGFR结合时要经历从“flipped”到“unflipped”的构象转换，因此猜测采用大环化策略可以将其固定在“unflipped”构象从而降低结合过程中熵增加导致的结合自由能损失。设计合成的大环化合物18c对EGFRLR/TM/CS具有强抑制活性，其与EGFRT790M/C797S晶体显示嘧啶母核与吲哚基团间的二面角为−29.6°（图7C），并将其固定在“unflipped”构象。但18c仍然对Ba/F3亲本有较强的抑制，前期研究发现在苯胺的2位取代可以提高选择性，因此通过在2位取代得到了化合物18j，尽管18j对EGFRLR/TM/CS抑制活性略有降低，但对Ba/F3亲本抑制显著减弱。化合物18j的细胞抑制效果和选择性还在耐药的肿瘤细胞得到验证，同时，也验证了其机制是通过阻断EGFR的磷酸化以及其下游的信号通路而实现的。该研究为EGFR四代抑制剂提供新的骨架结构。
（来源：J. Med. Chem.）
图7. A. 大环化合物设计策略。B. 化合物17g与EGFRT790M/C797S晶体结构。C. 化合物18c与EGFRT790M/C797S晶体结构。D. 化合物17g二面角扫描。
研究课题获国家优秀青年基金（81922062）、科技部重点研发计划国际合作项目（2018YFE0105800）、广东省科技计划国际合作项目（2018A050506043）和暨南大学资助。
|
