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——背景—— 前面给大家介绍了ALK一代靶向药克唑替尼（点此链接查看原文）和二代靶向药阿来替尼（点此链接查看原文）的研发过程，提到了大部分患者使用克唑替尼在1年左右会发生ALK耐药性突变，而克唑替尼很难穿过血脑屏障；虽然二代靶向药阿来替尼对一些ALK新突变效果很好（如L1196M，C1156Y和F1174L突变）。然而“道高一尺，魔高一丈”，患者依然很有可能出现新的耐药突变，如G1202R突变。因此，开发对ALK突变有效且能穿过血脑屏障的新一代ALK抑制剂依然是非常重要的。今天给大家介绍一下第三代ALK抑制剂劳拉替尼的研发故事。
图1. FDA已上市的ALK激酶抑制剂及上市时间。 ——先导化合物的优化—— 配体与大多数蛋白质的相互作用主要受亲脂性的影响。与设计克唑替尼一样，辉瑞的研究人员这次也是用亲脂效率LipE = pKi( or pIC50) – cLogD（cLogD表示分子的亲脂性，数值越大，越亲脂）来指导分子的设计。在同系物中，化合物的分子量与其中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）渗透性通常成反比，所以如果希望分子具有CNS活性，最好在保持分子活性的同时降低分子量。此前，辉瑞的研究人员基于结构、性质和效率的药物设计，得到了一系列广泛有效、渗透性好且代谢稳定的第二代ALK抑制剂（如表1所示）。与化合物1（克唑替尼）相比，6a（PF06439015）将ALK野生型和L1196M突变体的效力提高了105倍和128倍。虽然在活性方面取得了显著的改善，但6a的MDR BA/AB比值为10.9（辉瑞用体外的MDCK-MDR1迁移实验来评估小分子对CNS的渗透性，实验结果即BA/AB的比值大于2.5的话，一般意味着该分子难以透过血脑屏障），明显不能透过血脑屏障。类似地，化合物6b的体外清除率和CNS通透性均有所提高，但活性却大大降低了；6i是系列化合物中表现最好的，但后续实验发现6i的效力和激酶选择性并不好。通过一系列的化合物测试，研究人员发现表1的系列化合物都很难同时兼顾活性(L1196M IC50 < 25 nM)和低的MDR BA/AB比值(<2.5)。
表1. 化合物1和其他先导物的活性和ADME。 幸运的是，研究人员分别得到了6b、6h与ALK的共晶结构（如图2所示）。 6b的氨基吡啶与ALK的hinge区域形成氢键，苄基上的甲基和氟苯基都填充了疏水口袋，此外，芳基上的氟原子使邻位芳基C-H极化，增强了与Gly1269和Arg1253的主链上羰基的静电作用。三氮唑环有30°的扭转角，从而与Gly1202的C-H的距离仅为3.3Å，形成CH/π相互作用。Leu1256则填充了6b的U型构象形成的疏水口袋。 6h与ALK的共晶结构中，6h酰胺N-H与水分子形成氢键，酰胺C=O则通过水分子与His1124的羰基相互作用。6h和6i结构叠合发现酰胺与三氮唑基团的的朝向有偏差（酰胺的二面角（CCCO）为45°，而三氮唑基团（CCNN）为64°）。因此，酰胺的甲基没有指向与G-loop中的Leu1122，Gly1123和Val1130有更强疏水相互作用的方向。总的来说，相对于三氮唑6i，N-甲基酰胺6h离G-loop的骨架更远。
图2. 左图：6b与ALK的共晶结构（紫色），6b有独特的U型结合构象；右图：6h与ALK的共晶结构（青色），6i（绿色）的结构是通过计算模拟叠加的。 图2中的结构给研究人员提供了提高分子亲脂效率的机会：小分子的U型结合构象结构表明氟苯基与芳香杂环靠的很近，如果设计成大环，说不定会是“破局之道”。具体来说，有两种设计策略：一是通过三氮唑的4号C与甲氧基的C原子连接（如6b）形成大环，二是通过吡唑的C和酰胺的N原子连接（6e）形成大环。这种大环骨架既可以增强结合构象，也可以通过引入linker增加额外的相互作用，还能通过显著减少可旋转的键数目和增加埋藏面积来提高CNS通透性。 ——大环ALK抑制剂的设计—— 大环分子的设计策略： 首先是第一种设计策略。在分析6b共晶结构的基础上，研究人员合成了多种12 - 14元醚链大环化合物（如表2所示）。可以看出，同一系列的化合物环数越小，logD越大。因此环醚7a、7c、7e的LipE都比相应的7b、7d、7f的LipE高。7e表现出最高的LipE(4.4)，具有良好的活性（ALK IC50 = 1.0 nM; ALK-L1196M IC50 = 20 nM)。虽然相比于6b有更好的LipE和活性，但大环醚还是太亲脂了（logD > 3.0），缺乏所需的ADME和CNS渗透性。 第二种策略在保留十二元乙醚大环的高LipE基础上，利用内酰胺linker来降低亲脂性。研究人员通过计算模拟，认为大环上的内酰胺的N甲基可能与Leu1122，Gly1123和G-loop的Val1130有疏水相互作用，内酰胺的羰基氧可能通过水与Lys1150形成氢键。研究人员合成了一系列表3所示的带酰胺linker的大环分子，8a与ALK的共晶结构（图3）验证了研究人员的猜想。相比于6d，8a在分子量几乎不变的前提下，有着更好的活性，更小的logD；相比6e，8a在logD不变下提高了对gatekeeper突变体119倍活性。这些结果表明大环酰胺是潜在的ALK抑制剂，较高的LipE和较小的分子量允许其在保证活性的前提下，优化到所需的化学空间。
图3. 左图：6h与ALK的共晶结构（青色），8a（紫色）的结构是通过计算模拟叠加的；右图：8a与ALK的共晶结构（绿色）。 从表3可看出酰胺大环系列中细微结构变化对ALK活性的敏感性。首先是立体化学敏感性，8a和8d都相对于它们的对映体8b和8e，活性分别提高了210和610倍；然后是甲基敏感性，去甲基的8c相对于8a，活性和LipE都下降了；随后是芳香杂环的敏感性，8a/8d表明氨基吡嗪类似物的活性会有所提高，但相应的logD也增加了。这是因为氨基吡嗪相比于氨基吡啶多了一个N原子，该N原子由于埋在分子内部不能很好地溶剂化，但同时会降低了碱性从而使得logD上升了。 酰胺大环的初步结果是让人惊喜的，除了log D(2−3)在合适的范围内外，其通常会有较低的代谢清除率和低的MDR BA/AB值。接下来，研究人员对酰胺大环的2-氨基吡啶/吡嗪系列进行进一步优化，以期在单个化合物上平衡好活性、CNS通透性、ADME和激酶选择性。
表3. 酰胺大环化合物的活性、LipE、体外清除率和MDR BA/AB值。 选择性的优化设计： ALK激酶的ATP结合口袋有27个残基，其中ALKLeu1198在26%的激酶中是保守的（其他激酶在该位置常为Phe或Tyr），这个较小的Leu残基可能是获得选择性的关键。如TrkB激酶在该位置的残基为Tyr635。研究人员解析了8a，8j，8k，8m与ALK的共晶结构。当ALK结构中吡唑邻位取代基与TrkB的Tyr635距离过近，配体会和Tyr635发生碰撞，从而导致好的ALK选择性。如图4所示，8a的甲基C原子与Tyr635的距离为3.2−4.1 Å。相应的，8j、8k和8m/8l的距离分别为3.2−3.7 Å、2.1−3.1 Å和2.0−2.3 Å。8a和8j由于与Tyr635的距离适中，并不会发生碰撞，所以对TrkB的活性与ALK很接近；而8k、8m和8l对ALK的活性比TrkB高近40倍以上。这些结果都表明研究人员的设计思路是正确的。
图4. 左图：8a与ALK的共晶结构（绿色），8a与TrkB的共晶结构（紫色）；右图：8a、8j、8k、8m与TrkB残基Tyr635的局部图。显示的数字为8a的甲基上的C原子与Tyr635的距离。
表4. 酰胺大环类似物的活性、ADME和选择性。 8k（PF-06463922）的活性、选择性和药代动力学： 凭借良好的活性及选择性、低的体外清除率、还有潜在的CNS渗透性， 8k（即劳拉替尼）被选为重点研究的候选药物。与化合物1相比，8k对ALK的活性提高了62倍。此外，它对目前临床出现过的ALK突变体均有效（活性提高了40 - 825倍）。为了进一步研究8k对ALK和ROS1靶标的激酶选择性，研究人员对206个重组激酶进行了激酶筛选。结果只有10个脱靶激酶的活性比ALK-L1196M gatekeeper突变体低于100倍。 8k在药代动力学实验表现也很良好，其血浆清除率低，分布量适中，半衰期合理，生物利用度达到了100%。此外，研究人员还测试了8k对大鼠CNS的渗透作用。单次口服10 mg/ kg剂量的8k后，24小时后其在脑脊液与游离血浆的分布比值为0.31，而克唑替尼只有0.03。
表5. 化合物1和8k对ALK野生型和突变体的IC50值。
表6. 8k（PF-06463922）的酶基选择性。 ——临床实验—— 劳拉替尼早在2018年就被FDA获批上市，根据NCCN发布的2021v1版ALK阳性非小细胞肺癌（NSCLC）的临床实践指南（图5），目前劳拉替尼还只是作为一线治疗失败后的二/三线治疗。但劳拉替尼的相关临床研究一直在进行中。2020年，辉瑞公布了代号为CROWN的一线治疗ALK阳性NSCLC患者的三期临床试验结果（图6），说明劳拉替尼的一线治疗效果要远好于克唑替尼。目前劳拉替尼的中位无进展生存期（PFS）还没达到（图6A），但明显要好于克唑替尼的9.3个月。就如当初设计的一样，劳拉替尼的CNS渗透性很好。使用劳拉替尼的患者，一年内没有发生CNS病情恶化的比例高达96%，而相应的克唑替尼只有60%（图6B）。
图5. NCCN发布的ALK阳性NSCLC患者对二代靶向药耐药后的治疗指南。
图6. 劳拉替尼一线治疗ALK阳性NSCLC患者的3期临床实验结果。 ——讨论与总结—— 劳拉替尼的药物发现过程是相当经典的基于结构的药物设计。研究人员最初想通过改造克唑替尼得到对ALK突变体有效且能入脑的抑制剂，在得到活性相当不错的6a分子后，发现其很难透过血脑屏障。后续，根据6a与ALK的晶体结构发现可以通过构建大环在保留活性的分子构象的同时，改善分子的logD和CNS通透性。研究人员设计了两种构建大环策略，发现大环酰胺在logD和CNS通透性上都更有优势（其实可合成性也是考虑因素之一）。后续的分子优化就基本是水到渠成了，最后得到了ADME和CNS渗透性都很好的临床前候选药物PF-06463922（即劳拉替尼）。 后续的临床实验也基本验证了研究人员的设计思路。劳拉替尼目前只是作为一线治疗失败后的二/三线治疗手段，相信未来很有可能进入一线治疗。劳拉替尼已经在香港上市，但还没在大陆上市，估计很快会有好消息，让更多国内病人受益。 参考文献： 1. Huang, Q. et al "Design of Potent and Selective Inhibitors to Overcome Clinical Anaplastic Lymphoma Kinase Mutations Resistant to Crizotinib". J. Med.Chem. 2014, 57, 1170–1187. 2. Ted W. Johnson et al “Discovery of (10R)-7-Amino-12-fluoro-2,10,16-trimethyl-15-oxo-10,15,16,17-tetrahydro-2H-8,4-(metheno)pyrazolo[4,3-h][2,5,11]-benzoxadiazacyclotetradecine-3-carbonitrile(PF-06463922), a Macrocyclic Inhibitor of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) and c-ros Oncogene 1 (ROS1) with Preclinical Brain Exposure and Broad-Spectrum Potency against ALK-Resistant Mutations”. J. Med.Chem. 2014, 57, 4720–4744 3. Alice T. Shaw et al “First-Line Lorlatinib or Crizotinib in Advanced ALK-Positive Lung Cancer”. N Engl J Med. 2020; 383:2018-2029 |
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