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伊马替尼是治疗慢性粒细胞白血病的一线临床用药，能够特异性识别ABL1激酶结构域的催化口袋并使得激酶稳定在非活性构象状态，阻断激酶催化活性。尽管如此，伊马替尼在临床应用中面临着患者由于突变产生的耐药性问题，因而通过靶向ABL1肉豆蔻酰口袋设计别构抑制剂是目前克服竞争性抑制剂耐药性的一项研究策略。有研究者提出，伊马替尼在抑制激酶活性的同时，会促使ABL1构象整体呈现延展的活性构象，提出了ATP催化位点引起激酶构象转变的力学模型[1]，但构象转变的细节还缺少进一步的实验证据。最近，Tamjeed Saleh课题组在Journal of Molecular Biology上发表的题为“Imatinib can act as an Allosteric Activator of Abl Kinase”的论文中指出，伊马替尼与后几代临床药物相比，还有一定程度与别构口袋相结合的特性，该作用模式会促使ABL1激酶转变为延展的活性构象，从而增强激酶活性[2]。 ——生物学背景—— ABL1是属于酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine Kinase,TK）大家族的一种，通过催化酪氨酸的磷酸化过程修饰蛋白，调控多种生理过程。ABL1激酶主要包括一个激酶催化结构域（KD）和两个SRC同源结构域，正常情况下，SH3结构域翻译后修饰的N端肉豆蔻酰基团占据KD的C-lobe的结合口袋，从而使C端的一条α螺旋（αI）弯曲，为SH2结构域和C-lobe形成界面腾出空间，从而形成组装好的非活性构象。能否诱导αI螺旋呈现弯曲构象是该口袋别构抑制剂是否具有抑制活性的生理基础（图1A）。
图 1伊马替尼和ABL1在催化位点和别构位点结合 ——主要结果—— 通过将伊马替尼逐步滴定至放射性同位素标记的野生型ABL1中，随着伊马替尼：ABL的比例逐步滴定到2:1，监测到两个不同的结合过程，体现为关键残基化学位移的变化（图1B-D）。将化学位移扰动数据映射到ABL的结构上，如图1E、F所示，可见第一个结合过程是和催化位点相结合，第二个结合过程发生在肉豆蔻酰口袋中。在ITC实验中也能监测到两组结合过程，其中第二个过程的结合等温线斜率较小，表明结合能力较弱（图1G）。 为进一步研究伊马替尼与ABL1肉豆蔻酰口袋的作用方式，作者添加达沙替尼阻断了催化位点后，解析了ABL1-伊马替尼别构结合的晶体结构，如图2A所示（PDB ID：7N9G，尚未公开发布）。伊马替尼和别构口袋结合，分子中C20所连接的苯环插入的疏水空腔和GNF2、asciminib类抑制剂的三氟甲基、二氟氯甲基基团占据的空腔相同（图2D-F）。而伊马替尼的吡啶和嘧啶环还进一步向αI螺旋延伸（图2B），并和356位丙氨酸和517位谷氨酰胺形成氢键。此外，359位亮氨酸的化学位移变化最为显著，因此可能对结合具有显著贡献，且当它突变为丙氨酸后检测不到复合物的形成，而L359A也是后续作者展开讨论的一组突变体。  图 2伊马替尼在别构位点结合的分子相互作用 此外，将别构位点的伊马替尼与目前诱导αI螺旋弯曲的配体（肉豆蔻酰、GNF-2和asciminib）复合物结构叠合，作者发现伊马替尼和αI螺旋存在空间冲突，因而无法诱导αI螺旋形成弯曲构象，这种空间冲突和ABL1的别构激动剂DPH和frag2（图2G、H）的晶体结构中的空间冲突类似，因此从结构上解释了伊马替尼在别构位点扮演激动剂的角色。 为评估伊马替尼和别构口袋结合对激酶活性的影响，作者分别进行了低浓度（2mM，图3A）和高浓度（20mM，图3B）ATP环境下的酶活实验，测量了野生型、Y272H/L359A和Y272H/A363V两种ABL1突变体的磷酸化活性。其中，Y272H是影响伊马替尼作为正构口袋抑制剂的耐药突变，L359A和A363V则分别减弱和增强伊马替尼和别构口袋的结合能力。由图可以看出，Y272H突变显著减弱了伊马替尼的抑制作用，而A363V突变能增强伊马替尼在别构位点的激动剂作用，因此显示出更强的激酶活性。在更高浓度ATP存在时，伊马替尼更难以竞争抑制激酶活性，因此Y272H/A363V突变体中，随着伊马替尼浓度升高，酶活性提高，更显著体现其激动作用，而对抑制别构口袋结合的Y272H/L359A突变体，伊马替尼的浓度对酶活性则无显著影响。  图 3ABL1-伊马替尼的酶活性实验结果 作者通过这一系列核磁共振实验，提出了一种区分ABL1别构抑制剂和激动剂的核磁共振分析方法，即检测关键残基521号异亮氨酸，525号缬氨酸，529号亮氨酸的化学位移。结合过程会诱导这三个残基发挥较为显著的化学位移变化的配体被界定为别构抑制剂，而没有显著化学位移变化的被认为是激酶激动剂（图4）。  图 4区分别构抑制剂和激动剂的核磁共振方法 ——小结—— 总之，伊马替尼的别构激活功能在大多数临床应用中影响并不显著，但当面临催化位点产生耐药性时，或是和细胞ATP发生竞争时，与别构口袋结合的激动剂效应可能会被放大。当伊马替尼在别构口袋结合后，活性构象下在催化位点的结合亲和力也会受到影响。这解释了一些临床用药中早期反应较好，但高剂量用药并不能改善长期结果的这一现象。这启发了临床用药中，将正构抑制剂和别构抑制剂联用能够更大限度的分别发挥其对BCR-ABL的抑制作用。此外，由于激酶机制的复杂性，在后续激酶抑制剂的设计中，可能需要考察配体多位点结合的可能性。 参考文献： [1]. Sonti,Rajesh, et al. ATP site ligands determine the assembly state of the Abelson kinase regulatory core via the activation loop conformation. J. Am. Chem. Soc., 140.5 (2018): 1863-1869. Doi:10.1021/jacs.7b12430 [2]. Xie,Tao, et al. Imatinib can act as an Allosteric Activator of Abl Kinase. J. Mol. Biol., 434.2 (2022): 167349. Doi:10.1016/j.jmb.2021.167349 作者： 邓 博 |
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