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血小板在创伤愈合和组织修复中的重要生理作用，为人类血小板衍生物在再生医学中的应用奠定了基础。储存在血小板颗粒中的大量生长因子和细胞因子可以通过凝血酶激活和凝固自然释放，也可以通过冷冻/解冻介导的血小板溶解、超声或化学治疗人工释放。以不同的释放策略制备的人血小板裂解物被视为可以替代胎牛血清（FBS）作为培养基补充剂的合适选择，使人类细胞在无动物血清条件下高效增殖，在体细胞治疗和组织工程中具有广泛的应用前景。 1，血小板及其裂解物简介 生理状态下，血小板的生命周期只有8-10天，每天必须从巨核细胞中产生大约（15-40）x109个血小板，以维持正常的（1.5-4.5）x105/μL的血小板计数。发现血小板具有组织修复能力源于1969年《nature》杂志发表文章，使用自体富血小板血浆（PRP）添加到培养基来“培育”微血管内皮细胞，以保证移植灌注器官中血管完整性[1]。这篇文章也拉开PRP在临床上的火爆应用的序幕。到20世纪80年代，用血液里的血小板浓缩物反复冷冻/解冻和超声处理制备成人血小板裂解液(HPL)，被发现能够促进肿瘤细胞和原代成纤维细胞的增殖[2, 3]。随后对血小板衍生的多种生长因子进行深入分析表明血小板在血管再生和伤口愈合中起比较好的作用[4]。血小板主要在其α颗粒中储存了多种生物活性介质[5-7]，包括各种趋化因子和生长因子，如血小板衍生生长因子（PDGF-AA、-AB和-BB）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、脑源性神经营养因子（BDNF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、结缔组织生长因子(CTGF)和骨形态发生蛋白(BMP)等等，如下图所示。 活化的血小板不仅释放蛋白质，而且释放细胞微囊泡[8, 9]。血小板也含有miRNA[10]和mRNA[11]，这可能是在血小板形成过程中从巨核细胞转移过来的。
一旦组织和血管损伤，活化的血小板聚集和脱颗粒，释放凝血因子开始初级止血。同时，血小板活化后释放其颗粒内容物，其中的促炎细胞因子和趋化因子吸引巨噬细胞和粒细胞来清除受损的细胞和组织，以及帮助抵抗细菌污染[12]。这些介质的刺激和抑制作用引起成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的迁移和增殖，从而导致血管重塑和组织修复[6]。血小板在调节先天免疫和适应性免疫反应中的多方面作用也得到了详细的综述[13, 14]。由于血小板的α颗粒所含的细胞因子和生长因子的复杂性和异质性，导致血小板激活所释放的细胞因子和生长因子存在明显的个体化和制备批次之间的差异[15, 16]。相对于FBS，HPL来源个体之间和制备批次之间的差异更大，导致最终产品的质量以及对细胞生物学和功能的影响有很大的不同[17]。正是因为批次之间的差异巨大，所以目前对HPL是否能代替FBS，存在一些争议。2005年首次报道人血小板裂解物(HPL)可以代替胎牛血清用于间充质干细胞（MSC）的大规模培养和制备，能满足临床应用的需求[18]。随后有一系列的文章证明HPL能起到FBS的功能，促进MSC的增殖扩增[17, 19]。这种高效的细胞增殖刺激使MSCs能够在11-16天的单个培养周期内进行大规模的临床应用，而不需要进一步的传代，同时保持基因组的稳定性[20]。当MSC接种在羟基磷灰石-磷酸三钙(HA/TCP)生物材料上生长，5%的HPL对牙髓MSCs的增殖有明显的促进作用，然而，HPL的浓度提高到10%时，10%的HPL却显著抑制MSC增殖；而且5%的HPL明显促进MSC在体内和体外实验的成骨分化[21]。另有研究显示任何浓度的HPL（1%-60%）促进脂肪MSC增殖的效果均优于10%的FBS，而且20%HPL的效果最佳[22]。
HPL培养能提高脂肪MSC的增殖和向软骨分化，有利于治疗修复关节软骨损伤[23]。活化的血小板释放的细胞因子在肿瘤转移和关节炎中也一些不好的作用[24, 25]。有报道称骨髓MSC在仅添加HPL的培养基中扩增效率较低[26]。一些研究显示血小板裂解物培养MSC后，MSC的成骨或成脂分化能力降低[27]，以及表面标志表达改变和降低MSC的免疫抑制能力[28]。尽管血浆被认为含有许多营养物质和生长激素和IGF-1等因子，但是缺乏血小板活化释放的多种生长因子，因此单纯的血浆很少用于培养MSC的补充剂[17]。血液经过凝固后释放出血清，因涉及血小板的激活，因而含有多种生长因子，但是血清样本中生长因子的含量比浓缩血小板产生的HPL低30%至50%[29]。3，血小板裂解物（HPL）的制备 简而言之，这些HPL浓缩液可以通过以下方法制备（见下图）：(A)Buffy Coat法(主要在欧洲使用)或(B)PRP法(主要在美国和亚洲使用)，或(C)通过血小板抗凝技术(在世界各地使用)制备。技术流程图如下。200-300毫升的血液，大概可以得到200毫升的富含血小板的血浆。这个制备过程需要去除白细胞，使白细胞减少到低于5x106个/单位（美国）或低于1x106个/单位（欧洲）。血小板浓缩物可以保存在血浆中或血浆和血小板添加剂溶液的混合物中，其中含有氯化钠/钾、柠檬酸盐、磷酸盐和甘露醇[30]。诱导血小板释放生长因子和其他生物活性分子的四大方法：多次冷冻/解冻循环是最常见和最简单的，兼有效和经济的方式诱导血小板激活释放因子。典型的情况是，浓缩的血小板在-80℃时被休克冷冻，37℃时解冻，从而使血小板激活和碎裂[18, 31]。HPL制备工艺的最后一步是分装和质量检测，合格后放行使用。到目前为止，文献中描述的循环周期数从1到5不等，尚待进行系统的分析，以确定冻融循环的最佳次数和精确条件。这种方法是加入钙盐溶液(通常是CaCl2)[23]，以激活内源性凝血酶，从而纤维蛋白形成和血小板脱颗粒。也有人或重组凝血酶的直接激活[22]，但重组凝血酶的使用可能会使HPL用于细胞治疗的监管和批准复杂化。30多年来，超声单独或与冷冻/解冻循环相结合也被用作一种快速、高效和经济高效的释放血小板的方法。在20 kHz频率下超声作用30分钟可有效释放血小板颗粒含量[32]。从制备工艺上来说，S/D处理法略微复杂。用1%磷酸三丁酯(TNBP)和1%的TritonX-100在30℃下处理新鲜冷冻血浆（FFP）4小时，制备S/D-FFP。添加的试剂用大豆油萃取和不溶性C18树脂层析除去。用S/D-FFP免疫家兔，然后用未经处理的FFP吸附诱导的抗体，证实没有新的免疫原的形成[33]。这种方法还有一个好处就是可以灭活被脂质包裹的病毒[33]。不同的制备技术会对蛋白质的含量和组成产生重大影响[34]。HPL的蛋白质含量和组成的变化如何影响MSC的增殖、分化和免疫调节作用，当然值得进一步研究[35]。HPL里面的生长因子在血浆中很可能不稳定，因此注意低温保护[36]。温度、血浆保存时间、HPL制剂的反复冻融步骤对HPL的生长因子和营养功能以及最终对MSC的干细胞生物学功能的影响尚未得到充分评价。在两份报告中，有证据表明反复冷冻/解冻对生长因子含量有相当负面的影响，诱导MSC高表达HLA-DR[37, 38]。HLA-DR高表达，意味着MSC能促发人体内的免疫系统，导致MSC进入人体后快速地被人体所清除。
4，自体和异体HPL 自体HPL通常从全血标本中通过离心和分离PRP后获得，另有一个可选的离心步骤为浓缩血小板。与异体HPL生产一样，血小板激活是通过冷冻/解冻循环或在PRP中加入CaCl2或凝血酶来诱导纤维蛋白原转化为纤维蛋白凝块、血小板活化和生长因子释放。相对于异体，自体HPL的优点包括避免了供体来源的血浆携带病毒的任何可能风险。然而，在实践中，自体HPL的体积可能不足以满足临床细胞剂量。因此，自体HPL的使用可能仅限于需要少量MSC的应用。异体HPL的风险在于潜在的人类血液传播病原体（比如HIV、HBV、HCB和梅毒等等），这一风险可以通过目前在持照血液中心采用的献血者筛选和检测战略以及病原体灭活而大大降低。其实，自体HPL并非没有风险，这取决于自体本身是否携带各种致病病毒。虽然需要进行研究以确定捐献者年龄对细胞行为的影响，但单个捐献者的影响可能不那么重要，并将通过大规模制造同种异体HPL所需的集合来消除[29, 39]。下表总结了自体HPL和同种HPL各自的优点和局限性。 5，血型对MSCs的培养有没有影响？ 流式细胞仪检测不到可溶性AB抗原在骨髓MSC上的吸附[40]。这个可能与血浆或HPL的浓度有关。MSC在100%的AB血浆中孵育3h后从新鲜人AB血浆中吸附了少量的ABO抗原，这与抗原浓度和吸附时间有关；用AB血浆洗涤的MSCs在体外暴露于健康献血员的血液后引起更强的血液反应，并含有高滴度的ABO抗体；而10%AB血浆则不会出现这样的情况[41]。因此，用AB血浆制备的HPL培养MSC可以考虑避免给O血型人群使用。6，PRP、PRF和HPL的区别 PRP：platelet-rich plasma，即富含血小板血浆PRF：platelet-rich fibrin，即富含血小板纤维蛋白HPL：Human platelet lysate，即人血小板裂解物看名称就能大概判断这三者的区别。PRP去掉血小板、PRF去掉血小板和纤维蛋白，即可得到HPL；HPL只含血浆和血小板激活后释放的因子。各自有各自的生理功能和用途，这里不在详述。PRP≠干细胞，PRP不含有干细胞，如果有人用PRP当作干细胞来宣传，那就是忽悠。PRP和PRF的区别参照下图，根据是否含白细胞，PRP和PRF还各自分两种： 7，总结
血小板裂解物和胎牛血清，各自有利弊，只是这些年大家对血小板裂解物的热情比较高涨，有适合细胞产业化所需的宣传亮点（安全性、无动物源成份）。其实，认为血小板裂解物比胎牛血清更安全，这是“想当然”的思维。血小板裂解物一样面临着很多安全性问题，人类传染性病毒尤为常见。虽然胎牛血清是异种血清制品，但是很多牛的病毒并不具有人致病性，常见为引起免疫反应。而胎牛血清引起免疫反应的临床处理明显简单于人类传染性病毒所导致的疾病（艾滋病、乙肝等都是极难治愈）。所以，只要制备干细胞和免疫细胞的企业能保障安全性，注重各种致病微生物的检测，血小板裂解物和胎牛血清都是可以使用的。欧盟和美国FDA都没有禁止胎牛血清的应用，只是要求保障安全性！鼓吹血小板裂解物优于胎牛血清，是否带来大量血小板需求所导致的监管问题？注：本文发表于2019年3月31日 参考文献：略（暂不提供）
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