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作者：张小桥1，张福勇2 单位：1.广西医科大学第一临床医学院，2.广西医科大学第一附属医院
作者合影 【前言】 活化部分凝血活酶时间（APTT），是内源性凝血途径缺陷常用的筛查试验。单独APTT延长原因常包括：①内源性凝血因子缺乏，例如因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ等活性减低，常见疾病有血友病A，血管性血友病（VWD）等；②血液循环中存在抗凝物质，例如抗因子Ⅷ抗体、狼疮抗凝物质（LA）等。 不同原因造成的APTT延长，可能表现出截然不同的临床特点，例如血友病A可导致严重出血，而LA大多不会引起出血风险。2021年发布的《活化部分凝血活酶时间延长混合血浆纠正试验操作流程及结果解读中国专家共识》，对这种原因及其可能代表的临床特点作出了实验室鉴别，给临床诊疗带来了巨大帮助。 本文在APTT纠正试验的基础上，联合凝血特检、基因测序等整合报告，明确了一例罕见的凝血因子缺乏症，为临床安全开展手术治疗提供了强有力的实验室支撑！ 【案例经过】 1.现病史：患者，女，54岁，主诉：发现盆腔占位10余年；考虑子宫肌瘤。既往史：平素健康状态良好，有磺胺类药物过敏史。手术史：1990年外院行甲状腺旁腺瘤切除术，2005年在外院行乳腺纤维瘤切除史。初步诊断：凝血障碍。患者在外院数次就诊，均因凝血功能障碍未能接受手术治疗，今为进一步诊治到我院就诊，门诊拟“阔韧带肿物”收入院。 2.体格检查：T：36.7℃，P：79次/分，R：20次/分，血压：135/75mmHg。神志清楚，皮肤黏膜色泽正常，全身皮肤未见皮疹，全身皮肤未见皮下出血。 3.实验室检查：血常规WBC 6.14×109/L，RBC 4.31×1012/L，PLT 275×109/L，HGB 125g/L，肝肾功能基本正常，凝血四项异常，表现为单独APTT显著延长，如表1所示。 表1：患者凝血功能检查结果
4.处理经过 （1）APTT纠正试验明确延长原因：①1:1混合即刻试验结果为32.5s，结果提示可纠正，考虑因子缺乏；②1:1混合孵育2h试验36.3s，比即刻延长小于10秒，结果提示不存在抑制物。综合APTT纠正试验结果（详见表2）,提示该患者凝血因子缺乏，因此下一步检测内源性凝血因子。 表2：患者纠正试验的结果
（2）内源性凝血因子活性和血栓弹力图检测：内源性凝血因子检测发现，8、9、11、12因子基本正常（见表3），表明患者APTT显著延长与内源性凝血因子缺乏无关。然而，基于全血模型的血栓弹力图（见图1）却出现了意料之外的矛盾结果：R值延长，表明存在内源性凝血因子缺乏；K、Angle和MA值均异常，综合凝血指数CI为-8.4，提示低凝，存在出血风险。 如何解释上述矛盾结果？患者到底存不存在出血风险？手术风险扑朔迷离！ 表3：患者内源性凝血因子活性结果
图1：患者血栓弹力图检测结果 （3）考虑罕见接触系统因子缺乏：综合现有实验结果，我们考虑存在罕见的接触系统因子缺乏，为了加以验证，我们采用了2个实验方案：一是延长加入钙离子前的孵育时间；二是二代基因测序。 通过修改APTT检测内部参数，将加入钙离子前的孵育时间延长至20min，再次检测患者APTT，同时做了2个平行对照，结果显示：延长孵育时间以后，APTT显著缩短，缩短比例为33.8%，而另外两个内源性凝血因子缺乏患者的APTT基本维持不变。 表4：患者PK缺乏筛查试验
二代测序结果表明，患者的KNG1基因存在2个突变位点，其中5号外显子的突变在患者家系成员中同样检出了相同变异，而10号外显子在其他家系未检出，考虑是自发突变。实际上其他仅携带1个突变位点的家系成员，其凝血功能均正常。
图2：患者基因测序结果 （4）鉴别诊断：抑制物定量，狼疮抗凝物质检测、抗磷脂抗体谱，VWF抗原和活性等结果均未见异常。 5.整合报告助力临床诊疗：综上所述，患者明显延长的APTT主要考虑KNG1基因复合杂合突变所致，该基因编码前激肽蛋白，可造成缓激肽系统缺乏，导致APTT延长。结合延长复钙前的孵育时间试验结果，考虑该患者为激肽释放酶原（PK）缺乏可能性大。 综合患者所有检查结果，我们出具了整合报告，并给出了检验建议：①患者APTT显著延长，考虑与PK缺乏有关；②PK缺乏患者不导致临床出血现象，接受外科治疗时，如果不存在其它出血因素，一般不需要输注血浆等替代治疗[1]；③尽管PK缺乏患者不存在出血风险，但考虑此为罕见现象，建议必要时做好替代治疗预案，确保安全。 最后，患者在经历了3次被外院拒绝手术治疗的坎坷历程后，在我们整合报告的帮助下，于我院接受了腹腔镜下子宫肌瘤剔除术，术中出血约50ml，术程顺利，预后良好。 （横屏阅读，效果更佳） （横屏阅读，效果更佳） 【案例分析】 1.APTT纠正试验在本案例中有何作用？为何本案例考虑接触系统凝血因子缺乏？接触系统凝血因子（PK、HMWK）在凝血瀑布学说中起何作用？ APTT纠正试验可以帮助我们把不明原因的APTT延长，区分为缺乏凝血因子、存在抗凝物质（因子抑制物和狼疮抗凝物），也可以为下一步的诊断和治疗指出方向。本案例中，APTT纠正试验提示存在内源性凝血因子缺乏，而常规的凝血因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ）均未见异常，结果看似矛盾，但细想便知，问题指向了内源性凝血因子中的另外两个易被忽视的接触因子：激肽释放酶原（PK）和高分子量激肽原（HMWK）。 破损的血管暴露出内皮下的胶原，其带有负电荷的特性可以与血浆中游离的因子Ⅻ接触，从而使后者激活为活化的Ⅻa，继而依次激活因子Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ，启动所谓的内源性凝血途径。实际上因子Ⅻ的激活，还有赖于PK和HMWK的相互作用。Ⅻ活化以后，Ⅻa在HMWK的辅助下，裂解PK成为激肽释放酶（KK），KK有两个作用区，重链区与HMWK结合，轻链区与因子Ⅻ结合，正反馈地激活因子Ⅻ，从而大量的生成因子Ⅻa。因此，PK是催化因子Ⅻ激活的因素，而HMWK又是PK的催化因素[2-3]。 2.为什么延长复钙前的孵育时间，可使PK缺乏的APTT显著缩短？如果是HMWK缺乏，可以使APTT显著缩短吗？ 由上述可知，因子Ⅻ的大量激活，依赖于PK活化后带来的正反馈效应，而PK的活化又依赖HMWK的辅助作用，因此无论是PK还是HMWK缺乏，都可以限制因子Ⅻ的活化，从而带来APTT显著延长的表现。 当先天性PK缺乏时，KK生成减少，对因子Ⅻ的活化减缓，APTT显著延长；当延长加入钙离子前的孵育时间（即加入激活物后先孵育30分钟再加钙离子，开始启动APTT计时），因子Ⅻ有更多的时间通过接触来激活，因此加钙离子后，已有较多的因子Ⅻa形成，APTT的反应时间显著缩短。HMWK主要通过和KK的重链端结合，加速PK的活化，不是激活因子Ⅻ的主要因素，因此，先天性HMWK缺陷时，延长复钙前的孵育时间，并不能显著缩短延长的APTT。从而可以鉴别PK缺乏和HMWK缺乏这两种罕见的因子缺陷症。 需要指出的是：①本案例基因测序结果仅表明接触系统KNG1发生基因突变，并不能鉴别是PK还是HMWK的基因突变；②PK缺乏，延长孵育时间APTT显著缩短的概念仍需明确，也有文献指出[4]，APTT可缩短至正常范围内。
Thrombosis research,2010,126(2):e152-3. 3.如何评价血栓弹力图和凝血常规试验，本案例中血栓弹力图提示低凝，为何仍能安全进行手术？ 我们知道，血栓弹力图是基于全血模型的凝血反应，能够较为全面地反应凝血因子、纤维蛋白原和血小板的相互作用，评估凝血概貌。但是，血栓弹力图仍然需要结合凝血常规试验，全面考量各自的实验特点，综合评估，方能在复杂的临床场景中把握正确方向。 本案例中血栓弹力图启动凝血反应，模拟的是内源性凝血途径的启动，因此，涉及到任意一个内源性凝血因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ、PK、HMWK）缺陷的因素，均可以使R值延长；而K、Angle值和MA值，虽然分别反应的是纤维蛋白原功能、血小板功能，也受凝血启动延迟的影响，从而最终报告了综合凝血指数低凝的结论。 现代凝血瀑布理论对传统的瀑布学说进行了修正，外源性凝血途径激活以后，形成的TF-Ⅶa复合物，可以直接激活内源凝血因子Ⅸ，通过内源途径放大凝血反应，此即“外源启动，内源放大”的止血生理过程。从这个角度来看，在因子Ⅸ上游的因子Ⅻ、Ⅺ、PK、HMWK可不必参与生理止血过程，故而这些因子缺乏往往无出血风险。
基于细胞的止血模型，主要包括启动、放大、扩增三个阶段，发生在组织因子承载细胞和血小板表面。与凝血瀑布相较而言，更全面地涵盖了血小板和凝血酶的相互作用关系。启动阶段，实际上是“外源启动”的缩影，主要是因子Ⅶ、Ⅸ启动活化过程；放大阶段，实际上是“内源放大”的过程，凝血酶正反馈激活因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅺ，只是把血小板释放因子Ⅴ、从VWF手上争夺因子Ⅷ的过程阐述更明确；扩增阶段，是上述被活化的因子促进凝血酶原复合物（Ⅹa-Ⅴa-PL-Ca2+）生成，促进凝血酶爆发的过程。 因此，接触系统因子Ⅻ、PK、HMWK在正常止血机制中并不是必需的，相应缺乏一般不会导致出血风险，无需特别处理，可安全进行手术。因子Ⅺ承担了放大凝血酶的部分作用，但其缺乏可能导致的出血也与凝血系统无关，更多的是削弱了凝血酶对凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）的激活，从而减弱了对纤溶的抵抗，引起纤溶亢进带来的出血风险。 【总结】 本案例提示，做好出凝血检验，我们要具备全面分析凝血、抗凝、纤溶系统相互作用的能力，具备综合评价凝血常规检验、凝血特殊检查的能力；并且要与时俱进、持续学习，不把目光局限于实验室的一亩三分地，该出手时就出手，大胆地走近临床、服务临床，才能在疑难、罕见的出凝血问题中发挥好检验作用，使患者得到更大的收益。 【参考文献】 [1] Antonio Girolami, PamelaScarparo, Nicole Candeo, et al. Congenital prekallikrein deficiency[J].ExpertReview of Hematology,2010,3(6):685-695. [2] 夏薇,陈婷梅.临床血液学检验技术[M].北京:人民卫生出版社,2015:51-56. [3] 王建祥,肖志坚,沈志祥,黄晓军,周道斌,邱录贵.邓家栋临床血液学[M].第二版.上海:上海科学技术出版社,2020:1010-1015. [4] Corno A R , Campolo J , Redaelli R , et al. Automated APTT cycle for the rapid identification ofplasma prekallikrein deficiency[J].Thrombosis research,2010,126(2):e152-3. |
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