麻黄-大黄药对治疗急性肺损伤的作用机制研究

急性肺损伤（acutelung injury，ALI）是由病毒、细菌、感染等因素诱发的肺组织免疫炎症性疾病，由于免疫细胞的过度活化，炎症反应失控，形成炎症因子风暴，进而损伤血管内皮细胞和肺泡上皮细胞，造成肺组织通/换气功能障碍[1]。在众多的免疫细胞中，肺组织巨噬细胞参与了炎症的发生、发展全过程。肺组织巨噬细胞长期存在于肺中，是肺局部炎症微环境和炎症反应最重要的调节细胞，主要包括肺泡巨噬细胞、肺间充质巨噬细胞、支气管巨噬细胞等，其中肺泡巨噬细胞所占比例大于90%，是肺内巨噬细胞发挥生物活性的主体[2]。

研究表明，肺泡巨噬细胞极化失衡是导致炎症反应加剧和ALI发生发展的重要原因之一，巨噬细胞根据环境刺激反应的不同，可被激活为经典激活的巨噬细胞（classically activated macrophages，M1）和替代激活的巨噬细胞（alternativelyactivated macrophages，M2），被称为巨噬细胞的M1/M2型极化[3]。M1型巨噬细胞以吞噬杀菌、释放炎症因子、促炎作用为主，M2型巨噬细胞以释放抗炎因子、抑制炎症反应、促进组织修复功能为主。在炎症反应过重时促进肺泡巨噬细胞M2型极化能有效地抑制炎症反应，阻止ALI的发展[4]。

肺肠合治是中医药治疗ALI的临床常用治法，麻黄-大黄是体现肺肠合治法的主要药对，多个以麻黄-大黄为核心药物的方药被临床和实验证实对ALI疗效确切[5-7]。已有研究表明麻黄、大黄能抑制巨噬细胞M1极化，在哮喘和脓毒血症的治疗中发挥抗炎作用[8-10]。目前麻黄-大黄药对是否能够通过促进肺泡巨噬细胞M2极化抑制炎症反应，从而防治ALI尚不清楚。因此，本研究采用ip脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制备ALI大鼠模型，考察麻黄-大黄药对抑制炎症反应、干预肺泡巨噬细胞M2极化的作用。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量（250±20）g，8周龄，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK（川）2020-030。动物饲养于陕西中医药大学实验动物中心SPF级动物房，自由进食饮水。动物实验经陕西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（批准号2020DW-011-09）。

1.2 药品与试剂

大黄免煎颗粒（批号20120030）、麻黄免煎颗粒（批号20020037）购自四川新绿色科技发展有限公司；地塞米松注射液（批号20200902，5 mg/mL）购自重庆市先锋动物药业有限公司；LPS（批号065M8209V）购自美国Sigma-Aldrich公司；β-actin抗体（批号AF1627）、F4/80抗体（批号30325T）购自美国CTS公司；CD206抗体（批号sc-376012）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）抗体（批号sc-365858）购自Santa crus公司；精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）抗体（批号DF6657）购自Affinity公司；荧光FITC标记的IgG抗体（批号BA1101）、荧光Cy3标记的IgG抗体（批号BA1032）购自武汉博士德生物工程有限公司；APC标记F4/80抗体（批号123116）、PE标记CD206抗体（批号141705）购自Biolegend公司。

1.3 仪器

全自动高压灭菌器（日本三洋公司）；RM 2016型病理切片机（德国Leica公司）；JK-6型组织摊烤片机、JT-12J型脱水机（武汉俊杰公司）；HI650型离心机（湖南湘仪实验室仪器有限公司）；C2500-R-230V型微型高速离心机（美国Labnet公司）；DYCZ-40型电转仪（北京六一仪器厂）；ECLIPSE Ts2型倒置显微镜（日本Nikon公司）；cytoFLEX流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；EDC-810型qRT-PCR系统（东胜创新生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 药物的制备

麻黄9 g、大黄12 g为成人每次给药剂量，成人按60 kg体质量计算，动物给药剂量根据成人与大鼠体质量换算，确定大鼠的等效剂量为2.2g/kg，本研究中麻黄-大黄药对的低、中、高剂量组对应的剂量分别为2.2、4.4、8.8 g/kg。麻黄-大黄免煎颗粒溶于蒸馏水中，分别配制成质量浓度为1.1、2.2、4.4 g/mL的混悬液。

2.2 动物分组、造模及给药

60只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、麻黄-大黄低、中、高剂量（2.2、4.4、8.8 g/kg）组和地塞米松（5 mg/kg）组，每组10只。除对照组外，其余各组大鼠ipLPS（10 mg/kg）制备ALI模型[11]，造模后各给药组立即ig 2 mL相应药物，对照组和模型组ig等体积生理盐水，每8小时1次，连续3次。末次给药8 h后，大鼠ip 25%戊巴比妥麻醉处死，取肺组织备用。

2.3 麻黄-大黄对ALI大鼠肺组织病理的影响

取各组大鼠肺组织，固定于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，石蜡切片（3～4 μm），二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水；进行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察并拍照。

2.4 免疫荧光双标检测肺组织肺泡巨噬细胞表面标记物F4/80和M2肺泡巨噬细胞表面标记物CD206、IL-10的表达

取各组大鼠肺组织石蜡切片，脱蜡，梯度乙醇复水，加入枸橼酸缓冲液加热进行抗原修复；加入一抗F4/80（1∶100），于4 ℃湿盒中避光孵育15 h；加入荧光二抗染色（红色），加入血清封闭后，加入一抗CD206（1∶100）、IL-10（1∶50），于4 ℃湿盒中避光孵育15 h，加入荧光二抗染色（绿色），复染核，封片，于显微镜下观察并采集图像。

2.5 流式细胞术检测肺组织F4/80标记的肺泡巨噬细胞和CD206标记的M2肺泡巨噬细胞百分比

取各组大鼠肺组织，剪碎后加入0.5%胶原酶和0.25%胰酶，于37 ℃培养箱中孵育2～3 h，将肺组织悬液滤过、离心、清洗、重悬得到细胞，收集细胞，计数，分别加入F4/80（0.125 mg/test）和CD206（0.125 mg/test），4 ℃避光孵育30 min，1500 r/min离心5 min，避光孵育50 min；加入工作液，采用流式细胞仪检测分析。

2.6 qRT-PCR检测肺组织IL-10和Arg-1 mRNA表达

取各组大鼠肺组织100 mg，加入组织裂解液制成匀浆，Trizol法提取总RNA，并测定纯度和浓度。按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，进行qRT-PCR分析。反应体系为20 μL，PCR扩增程序：90 ℃循环预变性30 s；95 ℃变性5 s；60 ℃退火延伸34 s，共设定40个循环。相对定量法计算各指标mRNA的2−∆∆Ct值。引物序列由北京擎科生物有限公司合成，引物序列见表1。

2.7 Western blotting检测肺组织IL-10和Arg-1蛋白表达

取各组大鼠肺组织，加入裂解液匀浆，裂解30 min。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后分别加入IL-10（1∶1000）、Arg-1（1∶1000）、β-actin（1∶500）特异性抗体，4 ℃孵育过夜；PBST洗涤后，加入HRP标记的二抗（1∶5000），37 ℃摇床孵育2 h，显影并扫描胶片。采用Image-J凝胶分析软件定量条带强度，以ꞵ-actin作为内参计算蛋白相对表达量。

2.8 统计学分析

采用Graph PadPrism 7软件进行数据分析，实验数据以 表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA）。

3 结果

3.1 麻黄-大黄对ALI大鼠肺组织病理的影响

如图1所示，对照组大鼠肺泡组织结构完整，呈空腔状，肺泡排列整齐，周围间隙内无炎性细胞浸润；模型组大鼠肺泡塌陷，结构紊乱，肺间质增厚、水肿，间质内可见大量炎性细胞浸润，气道狭窄并可见大量红细胞；麻黄-大黄高、中剂量组大鼠肺泡结构部分恢复，肺间质增厚与水肿减轻，气道出血与炎性细胞浸润减少；麻黄-大黄低剂量组大鼠肺组织仍然可以见炎性细胞浸润与气道出血，肺间质水肿改变不明显，但可见个别肺泡结构恢复；地塞米松组大鼠肺泡结构部分恢复，炎细胞浸润减少，但仍可见肺间质水肿。

3.2 免疫荧光双标检测肺组织肺泡巨噬细胞表面标记物F4/80和M2肺泡巨噬细胞表面标记物CD206的表达

如图2所示，对照组大鼠肺组织偶见F4/80阳性（红色）和CD206阳性（绿色）肺泡巨噬细胞表达；模型组大鼠肺组织F4/80阳性和CD206阳性肺泡巨噬细胞数目增多，荧光表达增强，且部分CD206阳性细胞与F4/80阳性细胞共定位表达，表明在急性肺损伤发生时，LPS诱导肺泡巨噬细胞大量活化，同时部分肺泡巨噬细胞向M2型极化，呈现抗炎表型；麻黄-大黄各剂量组和地塞米松组大鼠肺组织F4/80阳性肺泡巨噬细胞显著减少，荧光强度减弱，CD206阳性巨噬细胞则明显增多，说明麻黄-大黄能够抑制肺泡巨噬细胞的活化，同时促进其向M2极化。

3.3 免疫荧光双标检测肺泡巨噬细胞表面标记物F4/80和抗炎因子IL-10的表达

如图3所示，对照组大鼠肺组织可见F4/80阳性肺泡巨噬细胞（红色）和IL-10（绿色）少量表达；模型组大鼠肺组织F4/80阳性肺泡巨噬细胞数目增多，荧光表达增强，同时IL-10荧光表达也明显增强，且部分IL-10和F4/80呈共表达，IL-10是由M2型巨噬细胞释放的抗炎因子，两者的共表达表明在ALI发生时，部分肺泡巨噬细胞会向M2型极化，同时释放抗炎因子以抑制炎症反应，减轻组织损伤；麻黄-大黄高、中剂量和地塞米松组大鼠肺组织F4/80阳性肺泡巨噬细胞减少，IL-10表达进一步升高；麻黄-大黄低剂量组可见大量F4/80阳性肺泡巨噬细胞和少量的IL-10的共表达，说明麻黄-大黄高、中剂量药物能促进M2肺泡巨噬细胞激活并释放抗炎因子IL-10，从而抑制炎症反应，缓解ALI。

3.4 流式细胞检测肺组织F4/80标记的肺泡巨噬细胞和CD206标记的M2肺泡巨噬细胞百分比

如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织F4/80标记的肺泡巨噬细胞百分比和CD206标记的M2肺泡巨噬细胞百分比均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组肺组织F4/80标记的肺泡巨噬细胞百分比均显著降低（P＜0.01），CD206标记的M2肺泡巨噬细胞百分比均显著升高（P＜0.01），进一步证实麻黄-大黄能够抑制肺泡巨噬细胞的激活，促进肺泡巨噬细胞M2极化。

3.5 qRT-PCR检测肺组织IL-10和Arg-1 mRNA表达

如图5所示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织抗炎因子IL-10和Arg-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，麻黄-大黄高、中剂量组大鼠肺组织IL-10和Arg-1 mRNA表达水平进一步升高（P＜0.01）。

3.6 Western blotting检测肺组织IL-10和Arg-1蛋白表达

如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织抗炎因子IL-10和Arg-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，麻黄-大黄高、中剂量组大鼠肺组织IL-10和Arg-1蛋白表达水平进一步升高（P＜0.01）。表明麻黄-大黄能够促进肺泡巨噬细胞释放抗炎因子。

4 讨论

目前针对ALI的治疗，尚无疗效确切的药物，糖皮质激素类药物因其具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，应用于ALI的治疗，尤其在新型冠状病毒肺炎导致的ALI中被广泛应用[12]。研究表明，地塞米松通过抑制巨噬细胞活化，在LPS诱导的炎症和ALI中发挥保护作用[13]。故本研究选用地塞米松为阳性对照药物，从肺泡巨噬细胞M2极化的角度来对比其与麻黄-大黄药对对ALI的影响。巨噬细胞是免疫系统应对外界刺激的第一道防线，在病原微生物的吞噬、抗原提呈等方面发挥着重要的作用，当有病原微生物入侵时，肺组织的巨噬细胞被唤醒并募集循环中的巨噬细胞向肺组织迁移，并启动免疫反应。流式细胞术检测发现大鼠ip LPS后，肺组织F4/80标记的肺泡巨噬细胞数量显著增多，同时病理组织学结果证实，肺组织发生了严重的损伤，这与文献报道结果一致[14]。

肺泡巨噬细胞在吞噬入侵肺组织病原微生物的同时也分泌多种细胞因子，通过不同途径启动免疫炎症反应，并调节着炎症反应的进程[15]。当病原微生物入侵时，肺泡巨噬细胞向M1极化，在吞噬入侵者的同时，释放炎症因子，促发炎症反应，从而激活机体免疫系统以尽快应对外来的刺激。然而肺泡巨噬细胞过度的M1极化则导致炎症反应加剧，造成肺组织损伤，由此看来，肺泡巨噬细胞似乎是导致ALI的罪魁祸首。然而，肺泡巨噬细胞会根据环境的改变而转换其极化表型，当病原微生物被逐渐清除，肺泡巨噬细胞则逐渐向M2型极化，释放抑炎因子，抑制炎症反应，促进受损组织修复。本研究结果表明，大鼠ip LPS后，F4/80标记的肺泡巨噬细胞增多的同时，CD206标记的M2型巨噬细胞的表达也部分增强，但由于M2型巨噬细胞的数量有限，仍不能有效地抑制炎症反应，因此，促巨噬细胞的M2极化是对抗M1极化，抑制炎症反应的有效途径之一。

肺肠合治法是中医临床治疗肺系疾病的经典治法，通常采用宣肺与通肠药物配伍，针对ALI初期肺热腑实证疗效显著[16-17]。本课题组前期研究肺肠合治法治疗ALI的作用机制时，发现体现肺肠合治的麻黄汤和大承气汤联合应用具有显著的抑制炎症反应、改善肺水肿的作用[18-19]。麻黄、大黄分别是麻黄汤和大承气汤中的君药，2药根据《方剂学》麻黄汤和大承气汤中用量分别为9、12 g[20]，故本研究选用麻黄-大黄药对依照前期药物剂量比3∶4来探索其对ALI大鼠的治疗作用。结果发现麻黄-大黄药对及地塞米松均可明显改善ALI大鼠的肺组织损伤，抑制炎症细胞浸润，减少肺泡巨噬细胞活化，改善间质水肿和肺组织结构紊乱等病理状态。免疫组化和流式细胞术检测结果均证实麻黄-大黄药对能抑制肺泡巨噬细胞的活化并促进其向M2型极化。

IL-10和Arg-1同属于M2型巨噬细胞释放的细胞因子，因此也被用来作为M2巨噬细胞的标记物[21]。IL-10是一种多效性细胞因子，可以在多种类型细胞中发挥免疫抑制或免疫刺激的作用。在炎症反应方面，IL-10能通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原II的表达，降低其抗原呈递作用，下调T淋巴细胞活性，抑制炎性细胞的激活、迁移和黏附；同时IL-10也能抑制炎症因子的合成与释放，内源性与外源性IL-10均能在转录水平强烈抑制IL-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α、粒-巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子的合成，从而起到抗炎的作用[22]。Arg-1可促使精氨酸降解为脯氨酸，而脯氨酸是胶原蛋白合成的基础物质，在促进损伤肺组织修复方面发挥了重要的作用[23]。免疫荧光双标结果证实，麻黄-大黄药对在促进肺泡巨噬细胞M2极化的同时，还能促进IL-10的表达，且IL-10与CD206呈共表达，这一结果证实IL-10的增多与AM的M2极化相关，随后的qRT-PCR和Western blotting检测结果证实，麻黄-大黄药对能提高肺组织IL-10和Arg-1 mRNA和蛋白表达水平。

本研究结果显示，麻黄-大黄药对可改善ALI大鼠肺组织炎症损伤，减少肺泡巨噬细胞的活化，同时促进肺泡巨噬细胞向M2抗炎表型极化，促进抗炎因子IL-10和组织修复因子Arg-1的激活与释放。本研究发现地塞米松虽然能部分改善ALI大鼠肺组织病理变化，但对肺泡巨噬细胞M2极化没有明显的影响，实验研究证实将含有地塞米松的脂质体递送到炎症部位的巨噬细胞中，会抑制纤维化肺组织中肺泡巨噬细胞的M2极化，降低肺组织中IL-10和Arg-1水平[24]。在急性炎症发生时，为了应对炎症反应的加剧，在巨噬细胞M1极化增强的同时，M2极化也会适应性的增强，以应对炎症反应[25]。因此地塞米松在抑制巨噬细胞M1极化，减轻炎症反应的同时也抑制了肺泡巨噬细胞M2极化。本研究仅观察了麻黄-大黄对肺泡巨噬细胞M2极化的影响，其促进肺泡巨噬细胞的M2极化机制还需要进一步研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：王旭红，闫曙光，惠 毅，史 捷，李京涛．基于肺泡巨噬细胞M2极化的麻黄-大黄药对治疗急性肺损伤的作用机制研究 [J]. 中草药, 2022, 53(9): 2715-2722.