膜片钳服务-离子通道-hERG筛选

向新立生物医药 2022-07-13 发布于北京

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膜片钳服务/离子通道/hERG筛选

药源性心脏毒性是导致药物撤市及新药研发失败的主要原因。1988 年，首个用于治疗心绞痛的药物心可定因导致 QT 间期延长和心源性猝死而被撤市。1990 年报道了首个非心血管药物（抗组胺类药物特非那丁）引发尖端扭转型室性心动过速（TdP）的病例。此后又出现多起抗生素药物和精神类药物等非心血管药物引发 TdP 的报道，司帕沙星、叔哌丁醇等众多上市的非血管类药物因此而撤市。针对非心血管药物致 TdP 的问题，欧洲专利药品委员会(CPMP）于 1997 年发布了文件“Points to consider”，推荐使用心脏离体组织进行体外电生理学研究来评估非心血管药物致 QT 间期延长的风险。之后人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）于 2005 年发布了指导文件 S7B“人用药品潜在致心室复极化延迟作用（QT 间期延长）的非临床评价”，国家食品药品监督管理总局（CFDA）也于 2014 年发布了“药物 QT 间期延长潜在作用非临床研究技术指导原则”，这些文件推荐了动物体内试验、基于细胞的体外电生理评价试验和其他相关试验，以评估药物对 QT间期的影响和致心律失常风险。研究表明 QT 间期延长与心脏动作电位（action Potential）的 III 期复极异常密切相关。hERG 钾电流（又称快速激活的延迟整流钾电流 IKr）在 AP 的 III 期复极化过程中发挥重要作用，hERG 钾通道蛋白（Kv11.1）的 α亚基由 hERG 基因（KCNH2）编码。hERG 基因表达异常或药物阻断 hERG 钾通道会导致 QT 间期延长，并增加 TdP 的风险。因此，QT 间期延长是新药安全性评价的关键指标之一，hERG 钾通道检测是临床前评价药物心脏安全性的关键步骤，ICH S7B 要求几乎所有新化学实体（NCEs）都要进行体外 hERG 钾通道检测，药企或药物研发机构在新药报批时需要上交hERG 试验研究资料。

hERG钾通道膜片钳检测方法

利用全细胞膜片钳记录hERG钾电流。细胞内外液体分别为：140 mM KCl, 2 mM MgCl2 , 10 mM HEPES,10 mM EGTA, 5 mM Mg 2 ATP, pH 7.2 with 10 M KOH；137 mM NaCl, 4 mM KCl, 4; 1 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl2 , 10 mM HEPES, 10 mM glucose, pH7.3 with 10 M NaOH。刺激程序：钳制电压为-80 mV，去极化至+40 mV，时程为 2000 ms，然后复极化到-50 mV，时程为2000 ms，每 15s 记录一次电流，以电流稳定的数据为有效数据。

以下为向新立生物公司检测数据

特异性阻断剂 E-4031 对 HERG 电流的抑制作用

Figure1.hERG current（Ikr）block by E4031

Figure2.Time course of E4031 block of hERG

Figure3.Concentration-response relationship for E4031 block of hERG

hERG检测结果的判断

目前最常用的方法是采用膜片钳技术测定药物对异源转染 hERG 钾通道的哺乳动物细胞（HEK293 细胞系、CHO 细胞系）上 IKr 的抑制率，得出阻断 50％hERG电流所需的药物浓度（即半数抑制浓度，IC50）。一般来说，IC50 小于 1 μmol∙L-1为阳性，提示致心律失常的风险较大，其中，IC50<0.1 μmol∙L-1为高风险，0.1-1 μmol∙L-1为较高风险，1-10 μmol∙L-1为中等风险；IC50 大于 10 μmol∙L-1时相对较安全，其中，10-30 μmol∙L-1为低风险，IC50>30 μmol∙L-1提示致心律失常的风险较小。目前有研究采用安全窗（safety margin）推测药物致 TdP 的危险，即 IC50 与 Cmax（药物治疗剂量下最大游离血浆浓度）的比值，IC50/Cmax>30，则药物不易导致 TdP。30 倍差距可能足以满足目前的临床前评估，但安全窗的确定也需考虑疾病的严重程度和医疗需求，对于如果不给予治疗就会死亡的疾病，如肿瘤、艾滋病、一些感染性疾病等，IC50 是 Cmax 的 10 倍可认为是安全的；对于较轻的疾病，如雷诺病、季节性鼻炎、湿疹等，或者服用药物过量会导致自杀倾向的精神病，100 倍甚至更高的倍数才可认为是安全的。