粪便样本太粗糙！如何解析菌群的空间信息？

这是《肠道产业》第 1043 篇文章

编者按

粪便样本为研究肠道菌群提供了一种便捷的手段。然而近年的研究表明，粪便样本提供的肠道菌群信息并不完整，而且也无法反映微生物的地理特征。

今天，我们共同关注菌群的地理空间特征。希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。

粪便样本的局限性

阿德莱德大学博士后 Raphael Eisenhofer 和他的同事最近发表的一项研究工作引起了广泛关注。他们通过解剖袋熊的肠道来了解其肠道微生物组的变化情况。当然，这并不是最简便的方法，收集粪便样本更简单易行，尤其是对于袋熊这样的濒危物种来说，但研究人员想要获取的信息远比粪便样本能提供的信息要更多。

Eisenhofer 指出：“一直以来，我们使用粪便样本进行微生物组研究，这主要是因为粪便样本容易获取。但正如我们所知，微生态学是一门与'位置’密切相关的学科，微生物与宿主发生相互作用的部位是研究中的重点。”

Eisenhofer 和其他合作研究人员在文章中描述了一只裸鼻袋熊和一只南方毛鼻袋熊胃肠道中的微生物生物地理学特征和微生物空间信息。Eisenhofer 表明，虽然仅使用两只袋熊进行研究具有一定的局限性，但该项研究仍然有让人振奋的新发现。

Eisenhofer 说道：“我原以为近端结肠与远端结肠中的微生物种类会有较大比例的相似度。”然而结果显示，在这两种动物中，近肛门的远端结肠与近小肠的近端结肠中，相同微生物种类的比例不足 20%。此外，两只动物近端结肠中的微生物群落的相似度高于同一动物中近端结肠与远端结肠间的微生物群落相似度。

Eisenhofer 的研究发现进一步推动了部分科学家们的研究进展，这些科学家们不仅关注肠道中存在哪些微生物，还关注肠道微生物的定位以及它们与宿主细胞及其他微生物间的相互作用。

迄今为止，在肠道菌群中发现的差异表明，微生物生物地理学可能具有功能性的影响。此外，这些发现还提示，仅仅基于粪便样本的微生物组研究对肠道菌群的描述可能不完整。

加拿大不列颠哥伦比亚大学的肠道微生物研究专家 Carolina Tropini 解释道，如果研究人员想调查河流生态系统的生物多样性，只观察河流下游的生物，他们就会错过上游发生的一切。

她进一步指出：“在微生物组研究领域，我们试图仅通过粪便样本，来描绘一个极其复杂的微生态环境，这种研究相当于是在河流下游研究整条河流的生态学。事实上，几乎所有生物学上有趣的现象并不会只发生在河流的下游。”

超越“粪便样本”之外的研究

2019 年发表的一项研究提示，从粪便样本中获取的信息与肠道内发生的实际情况并非完全一致。研究人员检测并比较了结肠健康人群和患有结肠癌人群的肠道隐窝（一种肠壁上的内陷结构）中的微生物群落组成情况，发现除肿瘤和健康部位的微生物群落存在差异外，健康人群的肠道隐窝中约 1/3 的菌群物种属于变形菌门（后更名为假单胞菌门），而该菌群物种在粪便样本中通常仅占约 1%左右。

致力于研究免疫系统对共生微生物的影响的洛克菲勒大学博士后 Gregory Donaldson 说道：“研究河流生态学的学者一直很认同的一个观点是，上游发生的事件往往会影响下游发生的事件，或许我们能够检测到一些现象，但并不会真正理解为什么这条河是这样的，除非你逆流而上，弄明白河流上游到底发生了什么。”

为了揭示通过粪便样本进行研究所缺失的信息，Tropini 和她的合作者尽可能实时地对肠道中定植的微生物进行可视化分析研究。

她解释道，当前研究中面临的主要困难在于研究人员很难看清楚像肠道这样受到保护的器官的内部情况，因此在实验过程中，通常需要使用安乐死动物模型。而对于人来说，通常需要对胃肠道的不同部位进行活检，以检测这些组织及其相关的微生物。但由于活检术前通常需要使用泻药清空胃肠道，这可能使得相关研究结果发生偏倚。根据 Tropini 所述，这好比一股龙卷风顺着河流呼啸而下，对河流两岸所造成的影响。

Tropini 已经成功开发出一种新型成像技术。该技术无需使用泻药，因此能够保证胃肠道样本的粘液层和微生物群落的完整性。

不仅如此，最近几天她还对能够通过微流控技术模拟肠道环境，并实时动态捕捉其生物地理学信息而感到振奋。研究人员将人类或小鼠上皮细胞接种到这些所谓的“肠道芯片”上，使其产生粘液，然后引入细菌来观察微生物如何与肠道细胞相互作用。哈佛大学威斯研究所的 Donald Ingber 小组已使用该种方法，成功地在类似芯片上培养微生物和人类肠道细胞数天。

Tropini 表示：“这绝对是一个非常简便易行的模型，但如果想模拟肠道内流动物变化的情况及其如何影响细菌的黏附，需要通过实时观察来做到这一点。” 然而，组织活检或动物胃肠道解剖仅仅是在单个时间点进行的观察。Ingber 的研究组报告说，基于芯片的培养方案具备的另外一个优点是研究人员可以设置氧气浓度梯度，从而使厌氧微生物和需氧微生物能像在肠道中一样生长。

解读微生物群落间的关联

除了影响常驻微生物的物理因素外，微生物本身也会产生相互影响。为了进一步解读这些关系，康奈尔大学的进化生物学家 Corrie Moreau 和她的研究小组检测了龟蚁肠道中四个部位定植的微生物。

她指出：“通过观察粪便中的微生物，可以了解所有正在发生的一切，但却无法弄清楚是不是有某些细菌在错误的地方增殖，以及不同种类的细菌之间是否存在竞争关系。我们在显微镜下，使用制表钳仔细解剖龟蚁肠道的各个部分，从而获得了消化道相关的细菌图像。”

Moreau 和她的同事发现，中肠内定植微生物仅由一种细菌为主导，而后肠内定植的微生物群落则具有更高的多样性。当研究人员进一步分析这两个部位的细菌基因组数据时，发现在中肠内孤立生存的微生物已经失去了与其他细菌竞争的全部基因，相比之下，后肠中定植的细菌则保留了产生抗生素的基因，用以保护它们的生存空间不受其他微生物侵犯。

Moreau 指出：“这项研究结果表明，细菌为了在肠道某部位获取最佳位置存在一定程度的竞争，而这也可能会影响到宿主。”

为了更深入地研究肠道中的微生物群落，哥伦比亚大学医学中心的 Harris Wang 及其同事受生态学研究方法的启发，开发了一种新型测序技术。Wang 解释道：“研究森林中的空间结构是一项艰难的工作，因为森林中有很多树木、灌木以及动物，我们无法一一数清，因此，可以划分出小块，并使用现有的分析工具来研究这些小块之间存在的差异。”

Wang 的研究团队将胃肠道或粪便样本固定于凝胶中以锁定它们的空间排列，然后再将凝胶碎破成直径约为 30 微米的小块，并使用特异的条码标记每个小块中的 DNA。通过测序分析，他们可以重新绘制出不同微生物的定位信息及毗邻关系。

在小鼠的胃肠道中，他们发现处于肠道不同位置的微生物，其毗邻的微生物种类亦不相同。当研究人员将小鼠的饮食从低脂饲料调整为高脂饲料后，不仅其肠道内定植的微生物组成发生了变化，其微生物的空间结构也出现了改变。由低脂饮食向高脂饮食转变后，小鼠肠道内的细菌所毗邻的微生物更加多样化。

Harris 说道，了解微生物的毗邻关系和相互联系对“下一步更好地了解微生物群落以及它们如何给我们带来所有这些我们所感兴趣的益处非常关键。”

宿主细胞是生物地理学研究人员所不能忽视的另一部分微生物毗邻成员。一项1月份发表的研究中，作者指出，免疫缺陷小鼠较免疫系统正常的小鼠，其肠道菌群更加多样化，并且肠道各个部位的微生物分布也更加均匀。

自 Donaldson 在加州理工学院攻读 Sarkis Mazmanian 教授的研究生以来，微生物和宿主之间的相互作用一直是他的研究重点。Donaldson、Mazmanian 和他们的同事发现，共生微生物利用粘液中存在的宿主抗体免疫球蛋白 A（IgA）在肠道内定植，相反，IgA 使得病原微生物很难在胃肠道中立足。

研究人员还发现，在无菌小鼠的结肠中，人类共生微生物脆弱拟杆菌会根据其是否靠近宿主上皮、定植于肠腔内或粘液中来改变相关基因的表达。

Donaldson 表示，上述研究结果和其他研究发现共同提示，宿主和微生物之间存在双向联系，但这种双向性使得相关研究变得非常具有挑战性。目前的研究尚未阐明微生物能否引导宿主细胞的行为，或者宿主细胞能否影响微生物的定位和行为。

据 Mazmanian 所述，微生物组学研究人员已经非常擅长通过 DNA 测序来分析微生物群落的组成。他解释道：“测序非常简单，我认为在该领域，我们所欠缺的是不够了解微生物存在时所产生的行为，如它们有什么产物，它们启动了哪些基因的表达，它们如何与肠道中的包括上皮细胞、免疫细胞或者神经元在内的其他细胞相互作用等。”

Moreau 表示，无论研究人员是在检测直径 30 微米小块内的微生物群落，还是在了解整个肠道的生物地理学，一个重要的开放性问题是，这些细菌是否会沿着消化道的方向影响宿主的健康。

她解释道，下一步研究计划将“梳理这些精细的相互作用”，并阐明生物地理学上的重新排列是否会影响健康状况。

如果是这样，那么生物地理学的相关研究可能会对粪菌移植和抗生素应用等治疗方案产生深远影响。

Wang 提出，当尝试将微生物群落引入肠道治疗疾病时（例如治疗艰难梭菌感染），微生物空间结构可能是一个重要的影响因素。他表明，如果共生微生物“通常存在于一些非常稳定的微生物群落中，那么也许真正需要移植的是整个微生物群落”，但当前尚不清楚粪菌移植是否能做到这一点。 

此外，由于抗生素能够杀死的微生物不仅仅是它们所针对的病原菌，因此这些药物可能会影响邻近菌株的生存能力。Wang 指出，当前的工作重点是要研究“微生物群落在空间上的相互联系，以及不同类型的环境变化将会如何改变这种相互联系。”