【原】间充质干细胞来源的外泌体治疗骨关节炎

间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性已在动物实验和临床研究中得到验证，越来越多的证据表明间充质干细胞主 要通过旁分泌机制发挥作用，外泌体在其中扮演着重要角色。外泌体是含有多种活性物质的细胞外囊泡，在细胞间和细胞内 的通讯中发挥关键作用。文章就不同间充质干细胞来源的外泌体治疗骨关节炎的研究进展进行综述，讨论间充质干细胞来源 的外泌体治疗骨关节炎的未来方向，为骨关节炎的治疗提供新思路。

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是严重影响软骨及 周围组织的退行性关节疾病［1］ ，发病基础是软骨的 退变，以关节软骨及软骨下骨的合成与降解失衡为 病理特点。关节软骨是关节表面的组成部分，起到 缓冲及分散压力的作用。软骨退变后，降解产物引 发关节内炎症，并伴有软骨下骨和滑膜的病理性改 变［2］ ，同时免疫系统通过生成促炎细胞因子和金属蛋 白酶产生局部炎症，参与关节破坏的病理过程［3］ 。随 着社会老龄化增速，OA发病率不断提高，成为医疗系统面临的严峻问题［4］ 。

然而，目前OA缺乏有效的 临床治疗手段，早期OA的治疗包括抗炎镇痛药物、 软骨保护剂和关节镜手术等［5］ ，但这些措施仅能缓 解临床症状，无法阻止疾病发展。晚期 OA 多采取 人工关节置换的手术治疗方案，手术可缓解疼痛， 恢复患者日常生活能力，但人工关节置换术后的假 体磨损、松动等并发症使其使用受到很大限制。因 此，寻找新的 OA 治疗方法一直是骨科领域的研究 热点之一。 

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是 一类具有自我更新能力的多潜能祖细胞，具有来源 广、分化能力强［6］ 等特点，在OA和软骨缺损的治疗 中具有重要意义，是目前临床细胞治疗和组织工程研究中常用的种子细胞。MSC 在体内的作用机制 复杂，目前越来越多的研究证实旁分泌机制是其发 挥作用的主要方式，其中 MSC 分泌的外泌体（exo⁃ somes，Exo）扮演着重要的角色［7］ 。间充质干细胞来 源的外泌体（MSC⁃Exo）可通过多种途径治疗OA，包 括促进软骨形成、加速组织修复和调节炎症反应 等［8］ 。

1 外泌体 

1.1 外泌体的特征 

细胞外囊泡（（extracellular vesicle，EV）根据形 态特征可分为Exo、微囊泡和凋亡小体［9］ 。其中Exo 是直径为30~150 nm的囊泡［10］ ，具有磷脂双分子层 结构，形态呈膜性扁平杯碟状，包含丰富的生物活 性物质，包括蛋白质、脂质和核酸［11］ 。Exo广泛分布 在外周血、尿液、唾液、腹水、脑脊液和其他体液中， 可通过超速离心、过滤离心、密度梯度离心、免疫磁 珠和聚乙二醇沉淀等方法提取［12］ 。目前，Exo 可使 用多种方法进行鉴定，包括纳米粒子跟踪分析［13］ 、 动态光散射、电阻脉冲传感、流式细胞术等［14］ 。Exo 的形成涉及以下阶段：细胞膜内吞形成内吞体，内 吞体向内出芽形成多个管腔囊泡，此时的内吞体又 称为多胞体，最终多胞体和质膜融合而分泌到细胞 外［15］ 。 

自从 Simons 等［10］ 首次在绵羊红细胞上清液中 发现Exo，Exo就开始受到广泛关注与研究。Exo在 细胞间和细胞内通讯中发挥关键作用［16-17］ ，与各种 疾病的发生和发展密切相关，包括肿瘤、免疫系统 疾病和神经退行性疾病。Exo具有广泛的生物学功 能，例如调节血管生成，参与抗原呈递和受体介导 的胞吞作用等。此外，Exo 可作为疾病诊断和预后 评估的生物学标志。 

1.2 外泌体的优势 

虽然MSC能有效地修复软骨损伤和延缓OA进 展，但是由于大量获取困难、移植后存活率有限、难 以维持软骨表型、无法准确预测长期的细胞行为及 细胞间的相互作用等原因，使MSC直接移植面临着 许多挑战［17］ 。此外，当MSC来源于老龄供体或在移 植前大量扩增时，增殖、分化能力会显著降低［18］ 。MSC还具有独特的环境敏感性，在不同微环境下行 为会发生明显变化［19］ 。例如，人类脂肪组织来源的 MSC在肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF⁃α）的刺激下会分泌促炎细胞因子，增强炎症反应［20］ 。研究表明，MSC⁃Exo不仅具有与MSC相似的生 物学功能，还具有体积小、免疫原性低等优点。Exo 能避免与细胞直接移植相关的大多数安全问题，比 如静脉注射细胞可能产生栓子，遗传变异或微环境 刺激可能导致细胞癌变等［21］ 。与无法去除的移植 细胞不同，Exo的治疗是暂时性的，在发生不良反应 时可以迅速停止。此外，纯化的Exos可以长期保存 而不会丧失生物学活性［22］ 。总之，MSC⁃Exo作为更 安全有效的治疗方法，具备更好的临床应用前景。

2 不同间充质干细胞来源的外泌体与骨关节炎

2.1 骨髓间充质干细胞 

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）是人类最早发现的干细胞，在实验 研究及临床应用中十分广泛。BMSC 具有易分离、 易增殖和高分化潜能等优势，因此被认为是组织工 程最理想的种子细胞。 

Cosenza 等［23］ 发现骨髓间充质干细胞来源的外 泌体（BMSC⁃Exo）可以抑制OA样软骨细胞中金属基 质蛋白酶13（matrix metalloprotein 13，MMP13）、聚蛋 白多糖酶 5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS5）和诱导型一氧 化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的产 生，促进Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ，Col Ⅱ）和聚集 蛋白聚糖（aggrecan，Acan）的表达，同时抑制细胞凋 亡和巨噬细胞活化。在胶原酶诱导的骨关节炎 （collagenase⁃induced OA，CIOA）小鼠模型中，Exo通 过促进软骨修复和降低炎症水平缓解OA进展。这 表明 MSC 可能主要通过 Exo 发挥治疗 OA 的作用。Gasado 等［24］ 研究发现在抗原诱导的滑膜炎白猪模 型中，BMSC⁃Exo 通过抑制滑膜淋巴细胞增殖和降 低TNF⁃α表达水平减轻了滑膜炎，动力学步态分析， 如摆动时间、姿态维持时间等参数较前改善，表明 BMSC⁃Exo可能通过免疫调节作用治疗滑膜炎。Qi 等［25］ 发现BMSC⁃Exo可以逆转软骨细胞由于白介素 1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）刺激导致的活力降低、细 胞凋亡及线粒体膜电位改变，进一步研究表明BM⁃ SC⁃Exo 通过抑制 p38 和 ERK 的磷酸化并促进 AKT 的磷酸化发挥作用。 

2.2 胚胎间充质干细胞 

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是早期 胚胎或原始性腺中分离获得的全能干细胞，可诱导 分化成几乎所有种类和功能的细胞，具有无限增殖、自我更新的特性。 

Zhang等［26］ 首次发现人类胚胎干细胞来源的外 泌体（hESC⁃Exo）对软骨组织的修复作用。在软骨 缺损大鼠模型中，Exo 注射组的膝关节形态学和组 织学评分有明显的改善，12周时软骨和软骨下骨缺 损完全修复，透明软骨与周围软骨整合良好，细胞 外基质（extracellular matrix，ECM）沉积接近正常，而 对照组仅表现为纤维软骨修复。Wang等［27］ 研究发 现hESC⁃Exo通过平衡软骨ECM的合成和降解延缓 OA 进展。在内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus，DMM）小鼠模型中，hESC⁃Exo增加 Coll Ⅱ的合成并抑制ADAMTS5的表达，有效地减轻 了软骨损伤，延缓了OA进展。Zhang等［28］ 研究发现 hESC⁃Exo通过增强细胞增殖和迁移、抑制凋亡和调 节免疫反应修复软骨损伤。该研究表明，Exos通过 激活AKT和ERK信号转导通路促进细胞增殖和迁 移并且增加M2型抗炎性巨噬细胞的浸润。这些结 果表明hESC⁃Exo介导的软骨修复是通过多种途径 共同完成。 

2.3 脂肪间充质干细胞

脂肪间充质干细胞（adipose derive mesenchy⁃ mal stem cell，ASC）是从脂肪组织中分离获得的干 细胞。ASC的组织来源丰富，易获取，能耐受缺血、 缺氧的软骨微环境引起的细胞凋亡，在 OA 治疗方 面表现出较好的效果［29］ 。 

Tofino⁃Vian等［30］ 研究发现脂肪间充质干细胞来 源的外泌体（ASC⁃Exo）通过抑制炎症和氧化应激阻 止OA成骨细胞的衰老。在体外炎症模型中，ASC⁃ Exo抑制β⁃半乳糖苷酶活性，减少炎症介质 IL⁃6 和 前列腺素 E2 的产生，显著下调因线粒体膜电位变 化和氧化应激导致的 DNA 损伤，这表明 Exo 可能 通过抗衰老作用治疗 OA。Ragni 等［31］研究发现 ASC⁃EV可抑制OA成纤维样滑膜细胞中促炎性细胞 因子和趋化因子的表达。此外，研究还发现细胞和 EV表面的透明质酸受体数量影响EV的内化。 

2.4 滑膜间充质干细胞 

滑膜间充质干细胞（synovial mesenchymal stem cell，SMSC）可通过关节镜获取且滑膜组织含量丰富 可再生。滑膜细胞和软骨细胞由共同的细胞群分 化而来，因此 SMSC 与软骨细胞的关系较其他间充 质干细胞更紧密，更利于软骨修复。 

Zhu等［32］ 研究发现在CIOA小鼠模型中，滑膜间 充质干细胞来源的外泌体（SMSC⁃Exo）可以通过增 强软骨细胞的增殖和迁移延缓 OA 进展，但没有完全修复软骨损伤，软骨表面仍然存在少许不规则瘢 痕。Tao等［33］ 研究发现SMSC⁃Exo通过WNT信号通 路激活转录因子YAP促进软骨细胞的增殖和迁移， 但是同时抑制了ECM的分泌。为了克服这一缺陷， 研究团队通过转染的方法获得过表达mir⁃140⁃5p的 SMSC⁃Exo，进一步研究发现它可以通过RALA信号 通路激活 SRY ⁃Box 转录因子 9（SRY ⁃box transcrip⁃ tion factor 9，SOX9），避免抑制ECM 合成，促进软骨 组织再生，延缓OA进展。 

2.5 其他干细胞 

2.5.1 髌下脂肪垫来源的干细胞 

Wu 等［34］ 研究发现髌下脂肪垫干细胞（infrapa⁃ tellar fat pad mesenchymal stem cell，MSCIPFP）来源的 外泌体（MSCIPFP⁃Exo）在体外可以抑制细胞凋亡、抑 制分解代谢因子的表达及促进 ECM 合成。此外， Exo中的miR⁃100⁃5p通过抑制mTOR信号通路显著 提高软骨细胞的自噬水平。在 DMM 小鼠模型中， Exo通过维持软骨细胞稳态缓解OA进展，改善步态 异常。 

2.5.2 诱导多能干细胞

Zhu等［32］ 研究比较了来源于诱导型多能干细胞 （inducible mesenchymal stem cell，IMSC）和 SMSC 的 Exo对OA的治疗作用。在体外，IMSC⁃Exo比SMSC⁃ Exo具有更强的促进软骨细胞增殖和迁移能力的作 用。在CIOA小鼠模型中，SMSC⁃Exo虽然能够减轻 软骨损伤，但是浅层透明软骨被纤维软骨替代，软 骨表面存在不规则瘢痕，而IMSC⁃Exo可完全修复骨 软骨损伤。

2.5.3 脐带干细胞 

Yan 等［35］ 研究表明脐带干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UMSC）来源的外泌体（UMSC⁃ Exo）通过激活转化生长因子β1（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β1）和 Smad2/3 信号通路促进软骨细 胞增殖、迁移和基质合成，抑制细胞凋亡。此外，研 究还发现3D培养的UMSC产生的Exo数量是2D培 养的 7.5 倍，能够更有效地促进细胞增殖和抑制凋 亡。 

2.5.4 羊水干细胞 

Zavatti 等［36］ 研究发现羊水干细胞（amniotic flu⁃ id stem cell，AFCS）来源外泌体（AFCS⁃Exo）在体外 可诱导THP⁃1细胞转变成M2型巨噬细胞，增强抗炎 因子IL⁃10和TGF⁃β1的表达，减弱促炎因子IL⁃1β、 IL⁃6、TNF⁃α和 IL⁃12 的表达。在碘乙酸诱导的 OA 大鼠模型中，AFCS⁃Exo通过促进M2型巨噬细胞极化修复软骨损伤。 

3 间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的未来方向 

目前为止，只有1项研究比较了不同类型MSC⁃ Exo治疗OA的效果［32］ ，而且比较方法未标准化。未 来需要更多的研究，进一步控制干扰因素，包括 MSC的干预方式、Exo的提取方法、Exo注射的剂量 与频率、动物模型的选取等，以探究最适合治疗OA 的MSC⁃Exo。此外，从临床应用的角度出发，除Exo 的治疗效果外，如何大量稳定获取Exo也需要纳入考虑范围。因此，分离及获取对机体损伤小，体外可多代甚至无限扩增仍能保持良好分化特性的干 细胞可能更受到学者的青睐。 

虽然 MSC⁃Exo 治疗 OA 已获得初步成效，但原 始获得的 MSC⁃Exo 存在部分缺陷或难以达到理想 的功能，改造MSC⁃Exo以增强其功能逐渐成为研究 的热门方向。Sun等［37］ 发现过表达miR⁃320c的BM⁃ SC⁃Exo可更高效地促进软骨细胞增殖，抑制MMP13 生成和增强 Sox9 表达。Jin 等［38］ 发现在 OA 患者的 滑膜成纤维细胞中miR⁃26a⁃5p的表达较低，而2型 前列腺素内过氧化物合酶（prostaglandin endoperox⁃ ide synthase 2，PTGS2）的表达较高，进一步研究发现 过表达miR⁃26a⁃5p的BMSC⁃Exo可通过抑制PTGS2 减轻滑膜成纤维细胞的损伤缓解OA进展。

总之，相比于MSC，MSC⁃Exo在治疗OA时更为 安全、方便和有效。目前，大部分研究都侧重Exo治 疗的表象观察，许多功能及作用机制尚未完全阐 明。但是，相信随着研究的进一步深入及突破性成 果的取得，Exo将在OA的临床诊治中发挥出巨大的 作用。

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