 导语 今天给同学们分享一篇多组学分析癌症的生信文章“Integrated multi- omics characterization of KRAS mutant colorectal cancer”，这篇文章于2022年7月4日发表在Theranostics期刊上，IF=11.6。在本研究中，作者整合了多组学（基因组学、转录组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学等）数据，以全面表征分子网络和生物异质性，并细化KRAS突变CRC的分子分层，这可能有助于组合的发展更适合KRAS突变CRC的疗法。总体而言，这些蛋白质组学分析为KRAS突变CRC肿瘤的生物学发现和治疗开发提供了新途径。 1.KRAS突变型与KRAS野生型结直肠癌的分子比较 作者总结了每个节点的KRAS激活信号通路和相关抑制剂（图1A）。一旦KRAS发生突变，KRAS中内在的GTP-GDP循环就会被破坏，从而使突变的KRAS蛋白在活性状态下积累，从而组成性地激活下游的MAPK和PI3K信号级联，从而导致细胞增殖和存活。框中列出的各种KRAS抑制剂是针对KRAS信号通路的每个节点开发的，然后在临床前或临床研究中进行评估（图1A）。Kaplan-Meier生信分析表明，通过全外显子组测序鉴定的KRAS突变组的结果较差（图1B），在调整年龄、性别、临床分期和MSI状态后，该关联在多因素回归模型中仍然显着（图1C）。为了获得对KRAS突变体(Mut)和KRAS野生型(WT)组不同临床结果的机制见解，作者基于转录组表达谱进行了基因集富集生信分析(GSEA)。KRAS-Mut组在肿瘤中的上皮间质转化和Wnt信号通路等致癌信号通路中表现出更高的富集（图1D）。然而，KRAS-WT组主要在基因组中表现出富集趋化因子受体结合趋化因子、淋巴和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用、PD-1信号传导等，表明免疫激活更强（图1D）。作者还利用蛋白质组学数据来识别差异调节与肿瘤恶性表型相关的IGFBP2和KRT18在KRAS-Mut亚型中显着富集，而与中性粒细胞和巨噬细胞相关的CD177、MMP1和ARG1在WT亚型中富集。和来自CPTAC队列的磷酸化蛋白质组学数据，并比较了KRAS-Mut与KRAS-WT肿瘤的全球差异调节。  图1 KRAS-Mut与野生型结直肠癌的分子比较 越来越多的证据集中在与肿瘤发生和免疫逃避有关的基因组突变，并在癌症进化过程中赋予选择性优势。作者首先比较了KRAS-Mut与KRAS-WT中的肿瘤突变负荷，并观察到TCGA和CPTAC队列没有差异。随后进一步比较了KRAS-Mut和KRAS-WT样本中的体细胞拷贝数改变(SCNA)和非整倍性评分。在染色体水平上，KRAS-Mut肿瘤比WT肿瘤表现出较低程度的臂级SCNA，且改变主要集中在chr5q、chr9q和chr12（图1F）。此外，作者观察到KRAS-Mut与WT肿瘤相比，非整倍性评分（肿瘤中手臂水平增益和损失的总数）显着降低（图1G）。使用体细胞相互作用函数，作者进行了成对的Fisher精确检验，以检测KRAS突变与CRC中最常见的25个突变基因之间的关系（图1H）。ARID1A和ACVR2A突变与肿瘤中的KRAS突变相互排斥，进一步表明CRC的遗传畸变。 2. 分析KRAS-Mut结直肠癌的单细胞转录组学格局 大量研究表明，TME在肿瘤进展和免疫逃逸中起着至关重要的作用，并对免疫治疗的反应产生影响。作者利用基于大量RNA-seq数据的xCell算法来量化基质和免疫细胞浸润，并研究了CRC中细胞亚群的变化。具有KRAS突变的肿瘤以上皮细胞和Treg细胞增加为特征，而KRAS-WT肿瘤以CD4T细胞、巨噬细胞、pDC等为特征（图2A）。  图2 分析KRAS-Mut结直肠癌的单细胞转录组图谱 为了更准确地描绘KRAS-MutCRC的细胞亚群景观，作者从SMC和KUL数据集中收集并整理了10x单细胞RNA-seq转录组数据，并通过互惠PCA工作流程将它们整合到组合的scRNA-seq数据集中。最后，共获得来自16个KRAS-WT和13个KRAS-Mut结直肠肿瘤的55539个单细胞，并通过Seurat4.0进行生信分析。作者采用基于图形的聚类方法基于PCA空间中的欧几里得距离，并使用Louvain算法进行模块化优化，以将CRC细胞聚类成具有差异表达特征的29个簇。通过基于标记的注释鉴定出六种主要细胞类型，即淋巴细胞/浆细胞、上皮细胞、成纤维细胞/内皮细胞、骨髓细胞、T/自然杀伤（NK）/NKT淋巴细胞和肥大细胞（图2B）。作者发现，基于卡方检验，KRAS-Mut与KRAS-WT肿瘤中T细胞、B细胞、骨髓细胞和基质细胞的分布存在显着差异（图2B），因此，作者提取了四种主要的细胞类型，并进一步将它们细分为特定的细胞亚群。作者采用与上述相同的工作流程，将T细胞、B细胞、骨髓细胞和基质细胞分别分为8个、5个、8个和11个亚群（图2C）。比较分析显示，KRAS-WT肿瘤中CD4T细胞、CD8T细胞和调节性T细胞的细胞亚群分布显着升高，而IgG浆细胞（B细胞）、SPP1巨噬细胞（骨髓细胞）和肌成纤维细胞（基质细胞）在KRAS-Mut肿瘤中显着增加（图2C、D）。 3. 识别KRAS-Mut亚群的分子亚型 作者进一步整合了来自CPTAC数据集的公开可用的转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据，以研究KRAS-Mut肿瘤的共识分子亚型和治疗脆弱性（图3A）。基于三种组学类型的无监督聚类使用相似性网络融合(SNF)方法对数据进行生信分析，并将KRAS突变CRC分为两个稳健的子集（KM1和KM2，图3B）。无监督聚类也应用于每个单独的组学数据层，并显示仅来自转录组、蛋白质组或磷酸化蛋白质组的子集的平均轮廓宽度小于来自集成多组学的子集（图3C），这表明整合三种组学数据可以更准确地对KRAS-Mut结直肠癌进行分类。该分析分别在mRNA、蛋白质和磷蛋白水平上鉴定出5种mRNA、10种蛋白质和19种磷蛋白作为亚型特征（图3D）。进一步探索识别特征在其他在独立的结直肠癌数据集中，作者利用TCGA、CIT和GSE87211队列中确定的mRNA特征和CCRC队列中的蛋白质特征在KRAS-Mut肿瘤中进行无监督聚类。作者进一步比较了CPTAC和TCGA并没有发现两个亚型之间存在统计学上的显着差异（图3E）。  图3 通过KRAS-Mut亚群的分子亚型识别结直肠癌患者的基因组和预后特征 为了探索亚型特征的潜在临床效用，作者比较了两个分子亚群之间的预后。CPTAC队列中的KM1亚型与更好的预后相关，并且相对于KM2亚型没有死亡结果，尽管考虑到小样本量，生存生信分析没有统计学意义（图3G)。作者还比较了独立队列中基于KRAS分子亚型的预后，并确定在TCGA、CIT、GSE87211和CCRC队列中，KM1亚型与更好的生存率显着相关（图3H）。多因素Cox比例风险回归生信分析进一步表明，在调整临床病理因素后，KRAS突变亚型与这些KRAS-Mut样本中的患者生存结果相关。 4. KRAS-Mut结直肠癌的肿瘤基因组变异 为了进一步了解KRAS突变的结直肠癌患者的基因组景观，作者分析了来自WES-seq和SNP阵列分析的体细胞突变数据。在CPTAC和TCGA队列中进行了SMG生信分析，并比较了KM1、KM2和KRAS-WT子集中的基因突变频率。TCGA和CPTAC队列的突变谱显示，ARID1A和BRAF在KRAS-WT亚组中的突变率高于KRAS-Mut亚组（图4A)。然后，作者分析了CRC肿瘤中KM1、KM2和KRAS-WT亚型之间在三核苷酸环境中发生的96种可能突变矩阵中的单核苷酸变体(SNV)(图4B)。  图4 KRAS-Mut结直肠癌中的肿瘤基因组图谱 随后，作者从基因组数据中提取了5个突变特征（图4C），包括SBS15和SBS44、SBS1的自发或酶促脱氨、和SBS10b（图4C）。归因于SBS44特征的突变计数显示KRAS-WT肿瘤显着增加，而SBS15特征显示KM1亚型显着减少（图4D）。作者还分析了KM1和KM2亚组的SCNA水平，发现KM1肿瘤明显升高。Arm级SCNA结果表明，chr2、chr5p、chr7q、chr8p、chr12和chr16中的细胞带包含最常扩增或缺失的区域。局灶级SCNA显示KM1亚型2q31.2、5p15.33、7q36.3和KM2亚型12p13.33的细胞带包含明显放大的局灶区，KM1亚型的16p13.3和KM2亚型的1p35.3-36.32、8p11.22、18q11.2的细胞带包含频繁缺失的区域（图4E）。CNA的基因组改变促成了KRAS突变亚型的分子异质性。 5. 以特定临床特征和分子过程为特征的KRAS突变模式 在CRC肿瘤中进一步探讨了KRAS突变模式与临床特征和分子亚型的关系。KRAS突变亚型的前50个差异表达的mRNA转录物、蛋白质和磷蛋白显示在热图中（图5A）。有趣的是，所有MSI阳性肿瘤都聚集在KRAS-WT亚组中，并导致高突变表型、MSI和免疫相关CMS1转录组亚型以及BRAF和ARID1A突变的聚集。KM2与晚期肿瘤分期、间充质表型、CMS4转录组亚型、ProS-C蛋白质组亚型和免疫亚型2相关（图5B），这表明间质浸润、血管生成和更糟预后。KM1亚型主要表现为肿瘤早期、CIN表型、上皮和代谢相关的CMS3转录组亚型、ProS-E蛋白质组亚型和免疫亚型1（图5B），这表明上皮特征和更好的生存结果。在TCGA队列中也得到了类似的结果（图5C)。  图5 以特定临床特征和分子过程为特征的KRAS-Mut模式 作者进一步分析了肿瘤生物学特征以探索KRAS-Mut亚群中具有代表性的免疫和癌症相关过程。在前六个差异分子特征中，KM2子集在CPTAC中表现出最高的巨噬细胞、MDSC、缺氧特征、EMT特征、Pan-F-TBRs和基质评分富集，其次是KM1子集和KRAS-WT子集队列（图5D）。作者还在TCGA队列中进行了相同的生信分析并获得了相似的结果。KM2的特征是活化树突细胞(aDCs)、脂肪细胞、星形胶质细胞、M2巨噬细胞、间充质干细胞(MSCs)等的增强，而KM1亚群以记忆B细胞和NK细胞为特征（图5E）。 6. 通过蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析KRAS突变模式的功能注释 接下来，为了进一步阐明KRAS突变亚型的生物学意义，作者在KM1和KM2肿瘤亚群的RNA、蛋白质和磷蛋白水平上进行了ssGSEA/转录后修饰(PTM)和Metascape生信分析。RNA和蛋白质水平的通路富集表明，KM1主要富集在过氧化物酶体、MYC靶点和Wntβ-连环蛋白通路中，而KM2主要富集在EMT、凝血、血管生成、KRAS信号上调和肌生成过程中（图6A）。磷蛋白数据集的PTM生信分析显示，KM2的特征是PKACA、VEGF、PI3K(LY-294002)和JAK(tofacitinib)的激酶活性上调，而KM1肿瘤的特征是MEK、PI3K的药物靶点/mTOR（dactolisib）和紫杉醇。此外，EMT过程的代表性蛋白（COL3A1、VIM、ECM1和LAMC1）和血管生成途径（POSTN、VCAN和ITGAV）在KM2亚型中显着过表达（图6B）。然而，RBM15和HNRNPM以及RFC4和CDK11B在KM1亚型中明显过表达（图6B）。然后，作者比较了CPTAC队列中KM1和KM2亚组中磷酸化位点的表达。作者发现粘附信号相关磷酸化位点FLNA-S1630和MYO1F-S1023以及间充质表型相关位点VIM-S5、COL1A1-S176和TFB1I1-S143的磷酸化在KM2亚组中显着上调。此外，在KM1亚组中，酪氨酸蛋白激酶受体EPHB2-S776和细胞周期相关蛋白CDK11A-S577和CDK13-S432的水平显着升高（图6C）。然后，作者进行了基于差异磷酸化位点的途径和过程富集生信分析作者发现许多途径和功能显着富集，例如基于肌动蛋白丝的过程，粘着斑和RhoGTPases的信号传导，并且这些功能和途径中的大部分是介导的通过KRAS亚型（图6D）。  图6 通过磷酸化蛋白质组分析对KRAS-Mut亚型进行功能注释 7. 揭示KRAS-Mut结直肠癌的亚群特异性疗法 为了探索KRAS-Mut亚型在CRC中的潜在脆弱性，作者在癌症依赖图(DepMap)数据集中比较了基于大规模RNAi筛选的结直肠癌细胞系之间的基因依赖关系。41个KRAS突变的CRC细胞系被整理并分类为KM1或KM2子集。作者确定了31个基因在KM1和KM2子集之间具有显着不同的分数（图7A），作者将13个基因确定为子集特异性癌症依赖性基因（图7B），其中，KM2亚型包括PI3K/AKT信号相关的ZFP36L1和VEGF信号相关的COL5A1和TLN1，KM1亚型具有细胞周期/有丝分裂依赖性CCNB3、RAD21和核心Wnt信号分子CTNNB1。  图7 分子特征与药物敏感性之间的相关性揭示了KRAS-Mut结直肠癌的亚群特异性药物 为了进一步确定KRAS突变CRC亚型的亚群特异性治疗剂，作者应用了三个药物反应数据库（CTRP-v2、PRISM和GDSC1）来研究KM1和KM2细胞亚群的潜在治疗剂（图7C）。进行KM1和KM2亚组之间的差异药物反应生信分析，以确定每组中估计AUC值较低的特定化合物。这些分析产生了8个CTRP衍生化合物（KM13个，KM25个）和10个PRISM衍生化合物（KM17个，KM23个）和11个GDSC衍生化合物（图7C）。随后进行了多视角生信分析以研究这些化合物在CRC中的治疗潜力。KM2亚型的6种化合物和KM1亚型的3种化合物的CMap评分低于90（图7D）。作者进一步比较了候选药物靶点的蛋白质表达模式，并检索了实验和临床证据以过滤潜在药物（图7D）。此外，氟尿苷和CDKi在KM1CRC患者中具有良好的治疗潜力。作者还探索了与每个KRAS亚型中对MEKi、ERKi或AKTi的敏感性高度相关的潜在基因调节因子，这可能是对这些抑制剂反应的潜在指标。最后，作者生成了一个示意图，总结了KRAS-Mut亚型中的信号通路，以概述作者在KRAS-突变型CRC中的发现（图7E）。 小结 总之，作者的综合蛋白质组学特征揭示了新的分子亚型和靶向KRAS突变结直肠癌中的信号蛋白、磷酸位点和基因组改变的治疗机会。尽管对这些治疗假设的验证超出了目前研究的范围，但对分子表型和突变谱的表征可能会在揭示KRAS-Mut肿瘤的分子异质性方面取得重大进展。 |
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