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今天给大家介绍一篇由来自西南医学中心的Andrew C. Liu课题组在PLOS Genetics上的文章，题为“NF-κB modifies the mammalian circadian clock through interaction with the core clock”，在这篇文章中作者研究了促炎转录因子NF-κB在调节时钟功能中的作用，并证实了RELA可以与生物钟转录元件直接结合发挥转录抑制作用。地球上的大多数生物都存在内部计时系统，以适应24小时的明暗周期变化，即生物节律。在哺乳动物中，内源计时系统在分子调控和神经环路等多个层面上都发挥作用。在分子水平上，昼夜节律是由细胞自主调节反馈环路产生的，在该环路中，基因激活剂（例如BMAL1和CLOCK）驱动基因阻抑物（例如PER和CRY）的表达，而基因阻抑物反过来又抑制激活剂的转录活性。生物钟协调包括炎症在内的细胞生理过程。最近的研究表明这两种途径之间存在串扰。然而，炎症如何影响时钟的机制尚不清楚。NF-κB是控制先天免疫和炎症的主要网络中枢，NF-κB的慢性组成型激活是许多疾病的主要原因之一，例如免疫疾病、代谢紊乱、神经退行性疾病、癌症和衰老。在这篇文章中，作者研究了NF-κB在调节中枢和外周生物钟中的作用。使用遗传和药理学方法的组合，发现NF-κB扰动改变了细胞和组织以及小鼠中的时钟振荡。此外，使用生化和生物物理方法，证实了NF-kB可以直接与BMAL1的反式激活域结合，与时钟调节因子CBP/p300、CRY的结合位点重合。并且像CRY一样，NF-kB抑制E-box转录，说明了NF-kB在炎症与昼夜节律网络中的重要作用。在早期的基因组筛选中，作者发现IκBα和IKK2敲减会导致生物钟节律的变化，暗示NF-κB通路有可能与生物钟存在串扰。因此，作者选用了几种常用的NF-κB通路抑制剂来继续进行验证。其中TPCA-1是一种选择性ATP竞争性IKK2抑制剂（NF-κB通路抑制），在Per2-luc的U2OS细胞中检测昼夜节律的影响，发现与IKK2敲低效应一致，具有长周期的表型（图1A）。为了更直接地评估NF-κB对时钟功能的影响，作者测试了经典NF-κB亚基RELA的过表达（NF-κB通路激活）是否影响昼夜节律振荡。结果发现过表达Rela的细胞表现出振幅降低和周期缩短的表型（图1B）。为了确定RELA如何影响昼夜节律振荡，作者通过qPCR检测了核心时钟基因的表达模式。RELA在所有昼夜节律时间都降低了DBP和PER3的表达水平（图1C）。除此之外，在小鼠SCN切片以及动物行为学检测中也都发现了类似的昼夜节律变化。 
图1：NF-κB影响了生物钟基因的表达以及U2OS细胞的生物节律。由于过表达RELA的细胞中CCGs（如DBP）表达的显著降低，暗示NF-κB可能直接影响E-box的转录。为了确定RELA对E-box转录的影响，作者在HEK293T细胞中进行了荧光素酶报告基因检测，发现RELA和RELB都有效地抑制了BMAL1/CLOCK转录活性。RELA显示出比RELB更强的E-box抑制，但RELA的抑制活性弱于CRY1。RELA的shRNA敲低缓解了这种抑制作用，报告基因活性水平显著提高（图2A-C）。随后作者继续检测RELA的抑制作用是否依赖于CRY，在Cry1、Cry2 DKO细胞中测试发现其仍然具有抑制活性。说明RELA以不依赖CRY的方式抑制E-box转录（图2D）。接下来作者继续通过Chip-qPCR试验进行验证，发现在E-box序列中有明显的的RELA富集，并且RELA的峰与生物钟元件有明显的重合（图2E,F），说明NF-κB通过在E-box处与BMAL1/CLOCK形成复合物间接抑制E-box转录。图2：NF-κB抑制了BMAL1/CLOCK介导的E-Box转录活性。 接下来作者通过免疫共沉淀(co-IP)验证Myc-RELA与Flag-BMAL1相互作用。发现在WT和Clock–/–细胞中检测到BMAL1和RELA之间的内源性相互作用，但在Bmal1–/–细胞中没有检测到其与CLOCK的相互作用。这些结果表明，复合物的形成依赖于BMAL1，但不依赖于CLOCK，RELA和CLOCK的相互作用是通过BMAL1间接发生的（图3A,B）。随后作者使用EMSA实验分析发现RELA的加入会使得BMAL1-CLOCK-E-box复合物减少，证实了RELA具有破坏转录复合物的能力（图3C）。由于RELA和BMAL1/CLOCK在E-box上形成一个复合体，作者接下来确定他们互作的特定域。NF-κB包含一个N端Rel同源域(RHD)和C端反式激活域(TAD)，Co-IP检测到BMAL1和RELA RHD之间的相互作用，但没有检测到TAD。BMAL1的N端核心结构域(NCD)包含bHLH和PAS结构域，负责二聚化和DNA结合，C末端调节域(CRD)的一部分与CRY1和共激活因子CBP/p300结合，它们的动态相互作用在实现昼夜节律振荡中起着至关重要的作用。并且有趣的是，与CRY1一样，RELA也与BMAL1 CRD相互作用（图3D,E）。表明，RELA可能通过与CBP/p300的竞争性结合来影响时钟功能。为了验证这一假设，作者进行了co-IP和蛋白质印迹分析，结果表明V5-BMAL1与Myc-RELA和CBP相互作用。并且，Myc-RELA能够有效地与CBP竞争与BMAL1 TAD结合（图3F）。接下来作者通过NMR进一步验证，RELA RHD加入前后收集15N-BMAL1 TAD的15N-1H HSQC光谱，发现RELA RHD的加入导致TAD螺旋基序的化学位移扰动，并且与结合CRY1和CBP的区域重叠（图3G）。证实了BMAL1和NF-κB之间的直接相互作用，并且CBP、CRY1和NF-κB都结合在BMAL1 TAD位点上。图3：RELA RHD与 BMAL1的TAD存在相互作用本文发现NF-κB可以影响哺乳动物的昼夜节律，RELA可以通过直接与核心时钟元件BMAL1结合来调节生物钟系统，研究NF-κB对昼夜节律的影响可能会揭示出疾病治疗的新方法。参考文献：
Shen Y., et al. “NF-κB modifies the mammalian circadian clock through interaction with the core clock protein BMAL1." PLoS Genet. 2021, 17(11):e1009933.
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