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前言： 化学发光蛋白质印迹法是一种高灵敏度的蛋白质检测方法。宽动态范围允许在很宽的蛋白质浓度范围内进行分析物检测。报告酶的线性响应与增强的化学发光 (ECL) 底物相结合，使检测方法适用于定量分析。 当与适当的化学发光底物结合时，报告酶偶联二抗可用于化学发光检测。如下图中所述，报告酶催化化学发光底物转化为发光产物。然后使用电荷耦合器件 (CCD) 数码相机或 X 射线胶片捕获光，从而识别感兴趣的蛋白质。 这期的主题是Jackson ImmunoResearch公司为大家讲解：化学发光免疫印迹。
图 ：化学发光检测。A.酶联二抗与目的蛋白的一抗结合。B. 将化学发光底物添加到抗体-抗原复合物中。C.报告酶将底物催化成发光产物，信号可以通过（CCD）数字成像仪或X射线胶片检测。 一：信号稳定性 分析物的信号输出是瞬态的，仅在酶-底物反应期间产生。信号会在底物耗尽时衰减，尽管酶会保持活性。在某些情况下，底物可持续长达 24 小时，但在分析物浓度高的情况下，信号输出可能只有几分钟。如果需要，可以通过添加新底物来刷新分析物信号。 为了优化信号到背景捕获并避免信号饱和，可能需要多次曝光。如果使用 X 射线胶片，在抗原低或一抗亲和力差的情况下，显影可能需要 24 小时曝光，并且在优化过程中可能会使用许多胶片。数字成像通过 5 秒到 5 分钟之间的信号捕获简化了曝光优化，并且可以以最少的资源或时间浪费生成图像。 二、定量 报告酶对 ECL 底物催化的线性特性使其成为定量蛋白质印迹的理想选择。Image J 和 Image Quant 是许多图像分析软件之一，可用于评估分析物带相对于对照带的密度（光密度），从而得出分析物的相对数量。 必须设置印迹，以使检测不在饱和J限，由实验试剂的滴定确定。必须包括加载控制，并且必须补偿背景信号。应该注意的是，如果需要非常准确的定量，使用标准曲线的 ELISA 可能更适用。 三、灵敏度 化学发光检测非常灵敏，皮克量的检测经常被报道。通过优化，可以检测到飞克量的分析物。可以使用具有不同灵敏度的化学发光底物，并且底物的选择可能取决于分析物的丰度。 多路复用——在同一个印迹上检测多种分析物 当蛋白质具有多个标签时，在同一印迹上检测多个蛋白质可能有助于测试蛋白质表达，例如用于纯化的 His6 和用于检测的更敏感的 FLAG。如果由于截断、蛋白水解或初级错误导致个初级没有检测到样品中的标签，研究人员可以探测第二个标签以确认表达。 化学发光蛋白质印迹不能进行多重检测，但可以使用剥离缓冲液剥离它们并用另一对抗体重新探测。剥离缓冲液通常很苛刻，可能会改变第二次初级获得的信号，因此不建议将剥离的印迹用于定量分析。荧光蛋白质印迹为检测多种抗原提供了一种更加可靠的方法——了解更多关于荧光蛋白质印迹的信息。 报告酶辣根过氧化物酶 (HRP) 是一种流行的二抗偶联物。与过氧化物缓冲液结合，HRP 将化学发光底物鲁米诺氧化为其激发态产物 3-氨基邻苯二甲酸酯。该产品在衰减到其基态时会发出 425 nm 的光，该信号可以被 X 射线胶片或 CCD 相机捕获。 有关 JIR 过氧化物酶偶联物的更多信息，请单击此处 五、Jackson公司：碱性磷酸酶偶联物 碱性磷酸酶可用于化学发光检测，底物为二钠-氯-5-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环癸烷}-4-基)-1-苯基磷酸盐），它被 AP 去磷酸化，产生亚稳态的苯酚二氧杂环丁烷阴离子，该阴离子在 466 nm 处发光（Schaap 等人 1989）。发射的光稳定长达 24 小时，允许多次曝光 X 射线胶片。 辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶偶联物是适用于所有免疫技术的敏感试剂。 文献参考： A E Kalyuzhny A (2016) Immunohistochemistry – Essential Elements and Beyond. Springer International Publishing Switzerland. A P Schaap, H Akhavan and L J Romano (1863) Chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA probes. Clinical Chemistry Sep 1989, 35 (9) 1863-1864; |
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