cfDNA、ctDNA、MRD和ctDNA-MRD。
cfDNA（circulating cell-free DNA）即循环游离DNA片段，指的是存在于外周血液循环中但游离于细胞外的小片段DNA。人体本就存在正常数量的由体内正常细胞死亡或直接分泌释放出来的cfDNA，而在肿瘤、妊娠、器官移植等特定情况下，少数异源性cfDNA可作为基因检测的标志物。cfDNA液体活检中研究得最为深入的分支是ctDNA在肿瘤诊疗中的应用。ctDNA（circulating tumor DNA）即循环肿瘤DNA片段，指的是由肿瘤细胞释放到外周血液循环的小片段DNA。即使在一个典型肿瘤患者中ctDNA占总cfDNA的比例不到1%，目前的测序技术也已经允许检测其所携带的肿瘤基因组信息了。另外，与CTCs（循环肿瘤细胞（circulating tumor cells），指脱离于实体瘤并进入外周血液循环的肿瘤细胞）相比，ctDNA在肿瘤患者外周血中含量通常比CTCs高，因此针对肿瘤早筛或诊断，ctDNA检测的灵敏度高于CTCs，但相应地CTCs的准确性也优于ctDNA。MRD可以是三个术语的缩写，分别是分子残留病灶（molecular residual disease）、可测量残留病灶（measurable residual disease）和微小残留病灶（minimal residual disease）。尽管更准确的翻译可能应该是可测量残留病灶，但目前我们使用较多的是微小残留病灶这一译法。总的来讲，MRD反映了肿瘤病灶的残留状况。经过治疗后，肿瘤患者体内可能还会有少量的肿瘤细胞残留，而这些肿瘤细胞数量可能少到不引起任何症状体征，通过细胞学镜检或血清学检查等传统手段通常无法检测到，检测需要借助灵敏度高的现代前沿技术如流式细胞术、PCR、NGS等。MRD即指这些标准细胞形态学分析无法检测到的少量肿瘤细胞，如果患者MRD阳性，意味着残余肿瘤细胞的量已足以被检测到。那么，ctDNA-MRD又是什么呢？它与MRD经常被混为一谈，但二者并不等同。ctDNA-MRD是通过检测ctDNA并使用某些算法推算出体内MRD状况的技术，因此它其实是基于ctDNA的MRD检测技术，而MRD是一个状态，一个难以直接观察而需要借助其他手段检测或通过其他标志物估计的实际状态。几个重要术语介绍完毕，下面我们讲讲MRD作为肿瘤标志物的来龙去脉，以及ctDNA-MRD在肿瘤诊疗中的应用方向。对MRD的检测可以追溯到40年前的血液肿瘤研究，如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。已有大量回顾性研究提示MRD是血液肿瘤复发的基础，MRD阳性意味着之前的抗肿瘤治疗并未完全起效，MRD从不可检测到可检测的转变或MRD增加与明显的疾病复发有关。例如，AML（急性髓系白血病）患者化疗后进行造血干细胞移植前流式细胞术检测到的MRD阳性与造血干细胞移植后复发独立相关，而MRD阴性则与某些血液肿瘤更长的缓解期和可能的更长的生存率有关。目前，美国和欧洲一些儿科学研究已将诱导治疗或巩固治疗后的MRD状况作为危险度分层的依据，并以此指导加减治疗。另外，在缺乏大样本前瞻性研究结果的背景下，2021年美国FDA发布了在血液系统恶性肿瘤新药开发中使用MRD作为替代疗效反应生物标志物的监管文件，MRD在血液系统肿瘤诊疗中发挥的重要作用可见一斑。综上，在血液系统恶性肿瘤领域，MRD可能可以作为早期检测复发的监测生物标志物，MRD测试结果可能会为某些患者选择缓解后治疗提供信息，然而支持使用MRD作为预测性生物标志物的证据仍然有限，也就是目前还难以确定在治疗前检测MRD是否能预测治疗效果从而指导治疗的加减或开展与否，亦尚不清楚是否在MRD检测阳性时提前干预而不是在明显的疾病复发时进行干预就可以改善结局。随着相关研究的开展，MRD与实体肿瘤的关系也越来越清晰，其中肺癌相关研究居多。对实体肿瘤患者而言，ctDNA检测具有无创抽血的明显优势，患者不必承担活检带来的风险，并且也允许了不同时间点的连续检测。在早期筛查和早期干预、辅助治疗、治疗后复发监测的过程中，ctDNA-MRD检测能帮助进行早期诊断和风险分层并提供指导治疗的依据。ctDNA可能在评估肿瘤负担方面发挥作用，因为在多种癌症类型中均已证明ctDNA水平与肿瘤大小相关，ctDNA检测值随肿瘤体积和期数递增。同时，易于血浆取样的优点，使ctDNA水平得以被纵向连续跟踪并得出肿瘤相关突变的状态和趋势，并经常用以评估潜在的肿瘤复发。因此，在产生更显著的临床症状和影像学表现之前，追踪ctDNA水平可以为临床医生提供另一种评估肿瘤负担和治疗效果的工具。对于MRD指导辅助治疗，一些研究表明，ctDNA可以用于检测包括肺癌在内的几种实体肿瘤术后MRD的存在。而目前人们普遍接受的观点是，MRD的检测将帮助医生识别出有可能从术后辅助治疗中获益的人群，使辅助治疗的决策得以因人而异，因为虽然有些患者经过辅助治疗后能实现更长生存，但辅助治疗对于另一部分患者可能是弊大于利的，这也是目前常规辅助治疗的总体有效率如此之低的原因。在结直肠癌领域，支持ctDNA-MRD检测作为术后复发状况评估的数据不断积累。2017年ASCO年会的一份报告中，在12例可检测到ctDNA的患者中，有11例发生了术后复发，相较而言，在132例ctDNA阴性的患者中仅有9例术后复发，该研究采用的是基于NGS的单核苷酸变异检测。在2022 ASCO会上，DYNAMIC研究提示，ctDNA指导Ⅱ期结肠癌治疗可减少一部分术后患者辅助化疗的使用（相关链接：中肿陈功教授：希望与困境共存——谈MRD检测与结直肠癌新辅助化疗）。在乳腺癌中也获得了类似的结果。对于肺癌最终治疗后的ctDNA检测的预测预后价值研究，最初也有几个有意思的病例。2014年，在CAPP-Seq（一项ctDNA检测技术）的验证研究中，有2例Ⅰb期NSCLC患者在术后辅助放疗后3-4个月后ctDNA检测结果为不可检出，在治疗后32个月和21个月他们也分别保持着临床无疾病状态。该报告还描述了一例Ⅱb期NSCLC患者，尽管该患者接受了放疗并有残留肿块，但治疗后未检测到ctDNA。该患者在治疗后22个月仍处于无疾病状态，与ctDNA检测结果一致，事后看来，该残留肿块应该归因于辐射引起的炎症变化，与肿瘤无关。一些早期研究通过记录术前和术后ctDNA水平的显著差异，提示了ctDNA-MRD在肺癌领域发挥的作用。在一项针对41例NSCLC患者的研究中，在手术切除前后10天内测量了6个常见肿瘤驱动基因的ctDNA突变频率，前后对比发现突变频率从中位数的8.88%下降到0.28%，最明显的下降发生在Ⅰ期疾病患者中，其中有一例患者的ctDNA从可检出下降到不可检出。这些数据表明，ctDNA水平动态反映了现有的肿瘤负荷，且Ⅰ期肺癌经过切除后MRD更有可能消失。另一项研究在76例接受根治性手术的早期NSCLC患者中报告了类似的结果，手术切除后，ctDNA突变频率从7.94%±4.78%显著下降到0.28%±0.32%。2017年Nature发表的TRACERx研究结果也表明ctDNA状态与早期肺癌根治性手术后的疾病复发密切相关。该研究通过对每个患者的原发肿瘤进行外显子组测序，为每个患者定制了单核苷酸变异的个性化panel（组套），然后使用ctDNA对患者进行纵向监测，若血浆中存在两个或多个预先确定的变异即判定为阳性结果。在随访期间（中位775天）14例发生复发的患者中，有13例患者在出现临床明显疾病之前先检测出ctDNA阳性，且ctDNA检测较影像学诊断中位提前了70天。相比之下，在未复发的10例患者中，只有1例出现了持续或复发的ctDNA阳性。上述研究的结果共同表明，ctDNA-MRD在肿瘤治疗的临床决策中有很强的潜在作用。而如果获得距离术后更久的测量值，这些结果可能会更明显。一项对50例NSCLC患者以及进行了骨科手术的健康对照组的分析显示，术后血浆DNA（cfDNA）浓度出现的峰值可能归因于组织创伤，而在3-6个月的随访中，除了2例NSCLC患者出现临床复发外，其他研究对象的cfDNA水平均下降到了基线浓度。尽管ctDNA检测在确定MRD方面有潜在的用途，ctDNA-MRD也极富前景，但目前多种问题限制了ctDNA-MRD在肿瘤诊疗作用的发挥。首先，ctDNA检测的敏感度有待提高。ctDNA能早期检测到MRD从而提前诊断肿瘤的复发，但是在早期肿瘤的检出率上敏感度却不高。据一项2014年的研究统计，仅50%的Ⅰ期肺癌被检测到ctDNA，而这个比例在Ⅳ期肺癌是100%。在2014年另一项研究中，在多达82%的Ⅳ期肺癌患者中检测到ctDNA，但仅在47%的Ⅰ期肺癌患者中检测到ctDNA。据报道，在使用一种同时结合了ctDNA和蛋白质生物标志物的检测方法（CancerSEEK）筛查8种癌症时，ctDNA和蛋白质生物标志物的敏感度差异不大。其次，ctDNA检测的特异性有待提高。cfDNA的存在导致存在来自多个来源的测序结果可能会使ctDNA测序的发现复杂化，并引入假阳性结果。此外，在上述TRACERx研究中，肺腺癌患者的预处理ctDNA检出率仅为19%，而鳞癌患者为97%，对该结果如此大的差异，并没有找到明确的原因。而且，尽管个性化panel的ctDNA检测具有高度的预测性，但其价格昂贵，性价比仍有待考虑。最后，即使MRD确实是一个良好的肿瘤标志物，也还有很多技术问题和实际应用问题需要解决。例如，对于流式细胞术、PCR、NGS都适用的患者，应该使用哪一种进行MRD评估？MRD检测水平在不同的机构是否可重复？进行监测时MRD应该在哪几个时间点进行评估？什么水平的MRD足以促使治疗方法的改变？治疗后MRD的减少是否一定预示了更好的无复发或总生存率？尽管人们对ctDNA检测的敏感性和特异性等种种局限性存在担忧，但目前的技术已经极大改进了ctDNA检测方法，各大临床研究也正在不断开展。在之后的系列文章中我们将继续介绍ctDNA-MRD的前沿技术和循证医学证据，敬请期待。[1] Walter RB et al.. Measurable residual disease as a biomarker in acute myeloid leukemia: theoretical and practical considerations. Leukemia. 2021 Jun;35(6):1529-1538.[2] Estey EH. Acute myeloid leukemia: 2013 update on risk-stratification and management. Am J Hematol. 2013 Apr;88(4):318-27.[3] Berry DA et al.. Association of Minimal Residual Disease With Clinical Outcome in Pediatric and Adult Acute Lymphoblastic Leukemia: A Meta-analysis. JAMA Oncol. 2017 Jul 13;3(7):e170580.[4] Abbosh C, Birkbak NJ, Swanton C. Early stage NSCLC - challenges to implementing ctDNA-based screening and MRD detection. Nat Rev Clin Oncol. 2018 Sep;15(9):577-586.[5] Chae YK, Oh MS. Detection of Minimal Residual Disease Using ctDNA in Lung Cancer: Current Evidence and Future Directions. J Thorac Oncol. 2019 Jan;14(1):16-24.[6] Moding EJ et al.. Detecting Liquid Remnants of Solid Tumors: Circulating Tumor DNA Minimal Residual Disease. Cancer Discov. 2021 Dec 1;11(12):2968-2986.相关链接 中肿陈功教授：希望与困境共存——谈MRD检测与结直肠癌新辅助化疗
作者：杜燕旋
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