 常记溪亭日暮，沉醉不知归路。 公众号：小小医生之有趣的医学
前言 请直接去文末看娱乐视频！ 01 转录本 转录本（Transcript Variant）：其实就是成熟的信使RNA（mRNA），是可以编码蛋白质的mRNA。 一个基因可以有多个mRNA，也就是多个转录本。 为什么呢？ 因为基因转录后，首先形成前体mRNA，然后剪掉内含子（intron），连接外显子（exon），5端加上个帽子，3端加个尾巴，然后形成成熟的mRNA。但是，在剪切的过程中，可能会剪掉外显子，把内含子保留下来，这样子就形成多个转录本（成熟的mRNA）。 其实，原因很复杂，其他还有很多原因！略过！ 大多数基因都有多个转录本，并且，每个转录本都可能会编码不同的蛋白，从而产生不同的功能。 查到一个网文：编码转录本最多的是肢带型肌营养不良相关基因SGCE，可以编码98条转录本（https://zhuanlan.zhihu.com/p/352702817）。 一般情况下，我们只研究一个转录本所编码的蛋白质。 02 如何选择转录本？ 我们平常研究某个基因，是因为该基因在某一特定的组织和细胞中表达，且具有特定的功能，所以我们只需要确定该基因的哪个转录本在这些组织和细胞中表达即可。 如何确定该基因的哪个转录本在某个组织和细胞中表达？ 首先，设计每种转录本特异性引物，然后通过RT-PCR就可知道哪种转录本在组织和细胞中特异性表达。那这个转录本就是我们接下来要研究的东东。 有网友认为：另外，当我们研究某个基因的功能时，通常会提取总的RNA，然后反转录得到cDNA，然后将cDNA连接到表达载体中，然后转化到原核或真核细胞中进行表达，然后进行后续研究。通过反转录获得cDNA时，引物的设计就是根据转录本设计的。而且之后我们会将表达的蛋白跑电泳后进行分析，那蛋白的大小是如何计算的呢，当然也是通过该转录本编码的蛋白的氨基酸序列计算的。 过表达：通常的做法是将基因的编码区(CDS，CoDing sequence)构建到质粒或者病毒载体中，然后导入细胞内，使基因的表达量增加。 03 选择哪个转录本 详见：https://zhuanlan.zhihu.com/p/91980379
我选择第一个转录本，在关键词里面有这个的（MANE select），是首选（但是，我用这个转录本设计引物，没有特异性）。
RefSeq Select标准和MANE方案：https://www.cnblogs.com/Sunny-King/p/Bioinformatics-Transcript.html NCBI网址：https://www.ncbi.nlm./refseq/MANE/?utm_source=blog&utm_medium=referral&utm_campaign=mane-pub&utm_content=20220406link1 04 如何设计引物 这个知乎网址写的很好：https://zhuanlan.zhihu.com/p/536488665 05 https://www.ncbi.nlm./
出来这个
上拉网页，点击这里：pick primer！
设置参数！
然后，就出来一大堆引物。
06 偶然间，发现一个网站，设计引物更好！ http://sg./scitools/Applications/RealTimePCR/Default.aspx 操作方法简要：https://www.docin.com/p-2010150685.html 07 这个网站更好 http://sg./scitools/Applications/RealTimePCR/Default.aspx 首先，查到基因的编码！ 怎么查？ 进入：https://www.ncbi.nlm./
点击！
把编码复制下来：NM_006157.5！ 设计引物 进入这个网址！ https://sg./scitools/Applications/RealTimePCR/Default.aspx
点击这些！
点击这个设计！
然后，引物就出来了。 Please wait while your request processes. This process may take several minutes. 网页要高速运算！ 网页运算完成后，下拉网页，引物出来。
选择第一个引物。 前引物：GCCAGCGGATTTTAACCAAG 后引物：GTTATGACCTCTACAGACACGG 验证引物 进入这个网址： https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 输入引物！
点击！
结果：慢慢的等，要等好几分钟！
Specificity of primers：如果没有特异性，这里会说there is no Specificity，没有说的就是引物有特异性。 Self-complementarity 和 Self 3’ complementarity是什么东西？ 3'-complementarit可用于预测引物二聚体，而Self-complementarity评分可用于预测引物本身甚至引物对之间可能的二级结构。 网络流传：Self complementarity0-3为理想状态；self 3' complementarity 严格＜1/4碱基数。 应该是：Lower is better，越低越好。 GC含量在40%-60%之间，Tm值范围为55-65℃的引物。 Tm(解链温度)是指50%双链被解开成单链时的温度。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。 往下拉网页，里面会显示，这个引物会扩增出哪些基因！ 我去，居然真的只有NELL1基因，并且四个转录本都可以扩增。 在PubMed搞了大半天，引物都没有特异性，居然这个网站搞定了。 08
杨柳岸，晓风残月。
 陈翔六点半：和老板同乘电梯的尴尬，谁能懂？ 陈翔六点半：这件事从一开始就错了。
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