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大多数蛋白质淀粉样聚集的研究是在稀释、均匀和混合良好的溶液中使用合成肽或蛋白质片段进行的，这与复杂的细胞内环境有较大的区别。细胞内环境与通常在体外使用的蛋白质溶液相比，最显著的特征之一是存在由生物分子液-液相分离 (LLPS) 形成的无膜细胞器。这些生物分子凝聚物可以调节淀粉样蛋白的聚集，一方面，淀粉样蛋白自身的液-液相分离可以作为替代的成核途径，促进胶状或纤维状聚集的发生，另一方面，预先存在的其它生物分子凝聚物可能作为定位中心与淀粉样蛋白发生相互作用，可能是其影响淀粉样聚集行为的更普遍的机制。2022年12月2日，来自奈梅亨拉德堡德大学分子与材料研究所的E. Spruijt研究组在Science Advances在线发表题为"Biomolecular condensates can both accelerate and suppress aggregation of α-synuclein"的研究论文，系统探究了预先存在的生物分子凝聚物对淀粉样蛋白α-synuclein（αSyn）淀粉样聚集过程的影响。在该研究中，作者选取了三种αSyn的突变体：野生型FL-αSyn，C末端截短的突变体αSyn-108和与αSyn淀粉样聚集相关的短肽NACore（αSyn-68-78），分别观察了三种突变体在三个生物凝聚体中的定位，这些生物凝聚体组成分别是RP3/polyU、pLys/pGlu和pLys/ATP，是细胞内无膜细胞器在体外条件下的模型体系。将αSyn的三种突变体标记Alexa Fluor 647荧光标签，分别与三组凝聚物混合，对每个体系进行共聚焦显微镜成像，结果如图1所示。FL-αSyn可以被RP3/polyU富集，对于pLys/pGlu和pLys/ATP，FL-αSyn明显地聚集在液滴与稀相的界面；αSyn-108则被三种凝聚物所排斥，NACore片段可以被RP3/ polyU液滴招募，被pLys/ATP液滴较弱地富集，但被pLys/pGlu凝聚体所排斥。FL-αSyn的无序区域既有带电氨基酸，又有疏水氨基酸，由此带来的两亲性使其可以定位在界面处。图1. 带有荧光标记的αSyn突变体在三种凝聚体中的定位为了阐明凝聚体对αSyn淀粉样聚集动力学的影响，作者进行了ThT试验。作者将没有任何其它物质影响的聚集过程作为参考，绘制了存在凝聚体时αSyn聚集的滞后时间（tlag，主要由一次成核速率决定）和基于ThT荧光强度的凝聚曲线的最大斜率（Vmax，主要由延伸速率和二次成核速率决定）的分布（图2）。为了区分凝聚物液滴与上清液中可溶性成分的影响，作者还对每个凝聚体系进行了液滴与上清液的对照试验。结果发现，对于FL-αSyn，RP3/polyU对其聚集动力学影响最大，滞后时间与参照相比缩短了十倍，但最大聚集速率与参照相比变化不大。在pLys/pGlu和pLys/ATP凝聚体存在时，FL-αSyn在上清液和凝聚物液滴中均表现出更快的聚集。对于αSyn-108和NACore，凝聚物液滴的存在反而使聚集速率降低。图2. αSyn突变体在凝聚体中的聚集滞后时间（tlag）和最大聚集速率（Vmax）的分布为了明确αSyn淀粉样聚集的速率是否与聚合在凝聚物中发生的位置有关，作者在FL-αSyn蛋白质内部连接了荧光共振能量转移(FRET)探针，发生聚集时染料对之间的距离变近，导致能量转移增强，作者分别计算每个像素的FRET效率，创建了FRET 效率图（图3）。在RP3/polyU中，FRET信号在凝聚液滴中增加，在界面处略有增强，而在液滴外则保持恒定且较低；对于pLys/pGlu，界面处的FRET高于液滴内外，表明在界面上存在更紧密的αSyn构象和更高的浓度，使αSyn在液滴表面更快地成核成纤维；对于pLys/ATP，在凝聚液滴内部观察到最高的FRET效率，液滴似乎随着时间的推移而成熟，失去了液体性质，在pLys/ATP凝聚物的界面上没有观察到聚集的FL-αSyn的积累，由此推测，即使在界面处成核，它们也会立即移动到液滴内部。图3. FRET标签标记的αSyn在凝聚液滴中的FRET分布显微镜实验表明凝聚物可以将αSyn定位到液滴内部或在界面处与αSyn发生相互作用，进一步调控αSyn的淀粉样聚集过程。为了证明这些相互作用也可能是聚集过程动力学中观察到的差异的原因，作者开发了动力学模型并将其拟合到实验数据中。该模型包含两个独立的部分：①αSyn被凝聚物液滴招募或排斥，液滴内外均可发生聚集；②αSyn定位到液滴界面，在界面处发生异相成核并进一步聚集（图4）。作者使用了模型①对FL-αSyn在RP3/polyU中的实验数据进行了拟合，使用了模型②对pLys/pGlu和pLys/ATP中FL-αSyn的实验数据进行了拟合，得到了三种凝聚物中聚集过程的初级成核速率、延伸速率和二次成核速率常数（图4）。对FL-αSyn，液滴内部的生长和二次成核速率常数低于溶液中，表明凝聚物内部环境对聚集过程具有抑制作用，这可能是由于液滴内部的拥挤和疏水环境引起的。然而，pLys/ATP和pLys/pGlu体系中存在着加速αSyn聚集的相反机制，FL-αSyn定位在界面上，导致加快的初级成核(pLys/ATP)和二次成核(pLys/pGlu)。凝聚液滴界面不仅可以作为蛋白质聚集的成核位点，还提供了独特的物理化学环境，使蛋白质的聚集得到了显著的增强。本文通过体外试验表明凝聚物可以通过多种途径影响淀粉样蛋白的聚集，当蛋白质定位凝聚物界面时，凝聚物可以显著加速淀粉样蛋白的形成，凝聚物也可以通过隔离和稳定淀粉样蛋白来抑制聚集。在细胞中存在多种由液-液相分离形成的无膜区室，类似的过程可能发生在活细胞中，这些区室可能通过隔离淀粉样蛋白防止聚集，也可能作为成核位点促进聚集。本文为αSyn在复杂细胞环境中淀粉样蛋白形成的早期阶段提供了一个新的视角，也为活细胞防止淀粉样蛋白的形成提供了一种可能的的机制。Lipiński, W. P. et al. Biomolecular condensates can both accelerate and suppress aggregation of α-synuclein. Science Advances 8, eabq6495, doi:10.1126/sciadv.abq6495 (2022).
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