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结直肠癌（CRC）是仅次于肺癌的第二大全球癌症死亡原因[1]。近年来，结肠镜检查率的提高促进了结直肠癌的早期发现，提高了结直肠癌患者生存率[2]。然而，有20%的CRC患者在诊断时已经发生转移，这部分患者的5年总生存率仅为10.5%[3-4]。此外，免疫检查点抑制剂（ICB）在绝大多数CRC患者中无效[5]。 最近的研究表明，许多CRC的肿瘤微环境（TME）具有免疫抑制作用。TME中缺氧、营养物质缺乏、代谢废物浓度很高，可导致免疫细胞功能失调。同时，由于肠道菌群产生特定的代谢产物，原发性CRC的代谢失调也受肠道微生物的影响。 宿主和肠道微生物代谢均可产生大量的氨，由于氨对许多细胞有毒性，正常情况下，代谢产生的氨被肝脏处理后通过尿素循环排出体外。值得注意的是，一些癌细胞可以通过吸收氨驱动氨基酸代谢，但是细胞外氨在TME中的作用尚不明确[6]。 近日密歇根大学的Yatrik M Shah教授团队在Cell Metabolism发表重要研究成果，他们发现结肠肿瘤微环境中有大量氨的积聚，并通过抑制T细胞功能来降低免疫反应。去除微环境中的氨可以重新激活T细胞，抑制肿瘤增长，并使增加肿瘤对免疫治疗的敏感性[7]。  文章封面 ICB治疗最近在肾透明细胞癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌等实体肿瘤方面取得了临床突破，然而在绝大多数CRC中，ICB治疗效果不佳。目前广泛使用的小鼠结直肠癌模型对免疫治疗反应较好，与人类结直肠癌的情况存在明显不同，既往文献表明，APC、KRAS和TP53基因突变在CRC中更为常见，因此研究团队在特异性靶向结肠上皮的他莫昔芬诱导CDX2-CreERT2小鼠中分别构建了单基因（Apc，SingleMut）、双基因（Apc和Tp53，DoubleMut）和三基因突变（Apc、Tp53和Kras G12D，TripleMut）模型。 随着他莫昔芬剂量增加，小鼠生存时间逐渐缩短。对于接受同等剂量他莫昔芬诱导的小鼠，TripleMut小鼠的平均生存期大约比DoubleMut小鼠短50%。此外，与SingleMut或DoubleMut小鼠相比，TripleMut小鼠的肿瘤数量增加，组织学分级更高，且发生了肺和肝转移。  TripleMut小鼠的平均生存期更短，肿瘤数量增加，组织学分级更高，且发生远处转移 研究团队接着评估了每个小鼠模型对PD-L1抑制剂的反应。结果显示，接受PD-L1抑制剂治疗后，SingleMut小鼠和DoubleMut小鼠生存率增加，TripleMut小鼠生存率未见明显提高，表明TripleMut小鼠模型对免疫治疗具有耐药性。  结肠癌原位转移小鼠模型对免疫治疗具有耐药性 基因集富集分析显示，与DoubleMut小鼠相比，TripleMut小鼠的适应性免疫和T细胞功能相关通路显著下调。质谱流式分析显示，TripleMut小鼠中CD44+/CD45-细胞增加，即肿瘤干细胞的比例增加。同时，TripleMut小鼠CD45+细胞和CD3+细胞显著减少，CD4+细胞和CD8+T细胞数量有所减少但不明显，表达抑制受体CTLA-4和PD-1的CD4+和CD8+T细胞显著增加。DoubleMut小鼠和TripleMut小鼠中性粒细胞和巨噬细胞无明显差异。总的来说，这些发现表明TripleMut小鼠整体T细胞更少，且存在更明显的T细胞功能障碍。   在TripleMut小鼠中，T细胞减少，表达抑制受体的T细胞增加 为了确定DoubleMut和TripleMut小鼠之间差异表达基因所必需的上游调控因子，研究团队结合CHIP-SEQ、RNA-SEQ结果，通过生物信息学分析将研究聚焦到与KRAS相关的转录因子，最终确定了四个潜在的候选蛋白：GFI、HNF4a、RUNX1和IRF蛋白家族。 分析TCGA数据库中相关数据集评估HNF4a及其直接靶点（癌性和正常结肠中的OTC）的RNA表达后发现，与正常结肠组织相比，CRC中HNF4a和OTC表达明显下调。SingleMut、DoubleMut和TripleMut小鼠模型显示肿瘤上皮中Otc和Hnf4a表达水平也显著降低，且TripleMut小鼠中这一改变最明显。 由于发现了Hnf4a、Otc和其他氨相关基因的下调，研究团队评估了CRC中氨的积聚情况，与DoubleMut相比，TripleMut小鼠结肠上皮氨染色显著增加，质谱分析进一步验证了这一发现。 研究团队还发现，在三种胃肠道癌症（结肠癌、胃癌和肝细胞癌）中，氨相关基因表达与生存率降低相关，且这一特征存在胃肠道特异性。 这些结果表明，小鼠和人类结直肠癌中氨代谢失调导致瘤内氨积聚，可通过氨相关基因表达情况对结直肠癌患者进行预后分层。  晚期结直肠癌氨代谢异常 由于前期研究结果表明，TripleMut小鼠整体T细胞更少，且存在更明显的T细胞功能障碍，研究团队接着探索了肿瘤微环境中氨的积聚对T细胞的影响。 研究团队分离了野生型小鼠T细胞，在体外用氨处理后进行靶向代谢组学检测，结果显示，氨处理后T细胞转硫途径失调。在体外和体内氨处理CD4+和CD8+T细胞后，观察到活性氧（ROS）和脂质过氧化显著增加，但在CRC细胞系中没有这一现象。实验结果表明，高氨水平通过转硫途径的失调诱导T细胞氧化应激。  氨通过抑制转硫途径诱导T细胞氧化应激 根据上述研究结果，研究团队尝试进行氨清除，降低氨水平。鸟氨酸可以通过刺激尿素循环和谷氨酰胺合成来清除氨，在临床上被应用于高氨血症患者。饮食中添加氨的小鼠接受鸟氨酸治疗后，血清氨显著降低，T细胞增殖增加，T细胞功能恢复。 另外，鸟氨酸治疗显著抑制CRC模型小鼠肿瘤生长，肿瘤Ki67的表达和氨水平显著降低，CD44+肿瘤干细胞减少，CD4+和CD8+T细胞增加。   中和氨可以减少结直肠癌肿瘤的生长 确认降低氨水平可以挽救CRC小鼠模型中氨驱动的T细胞功能缺陷后，研究团队还评估了降低氨水平是否能提高PD-L1抑制剂治疗CRC的疗效。结果表明，单独使用PD-L1抑制剂或鸟氨酸不能提高小鼠存活率，但鸟氨酸和PD-L1联合治疗可显著提高生存率。PD-L1抑制剂和鸟氨酸联合治疗可显著抑制T细胞衰竭，促进T细胞浸润。  降低氨水平可以提高CRC对ICB敏感性 总的来说，研究团队发现ICB治疗无反应和/或预后较差的CRC患者TME中氨水平升高，氨是CRC中关键的免疫抑制废物。在CRC晚期，OTC和HNF4a表达下调，导致氨积聚，T细胞转硫调节异常，T细胞衰竭增加，从而导致ICB耐药。清除氨能够重新激活T细胞，可以作为提高ICB在CRC中的有效性的新方法。  氨积累在结直肠癌进展中的作用概要图 参考文献 [1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi:10.3322/caac.21660 [2] Holt PR, Kozuch P, Mewar S. Colon cancer and the elderly: from screening to treatment in management of GI disease in the elderly. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2009;23(6):889-907. doi:10.1016/j.bpg.2009.10.010 [3] Biller LH, Schrag D. Diagnosis and Treatment of Metastatic Colorectal Cancer: A Review. JAMA. 2021;325(7):669-685. doi:10.1001/jama.2021.0106 [4] Araghi M, Arnold M, Rutherford MJ, et al. Colon and rectal cancer survival in seven high-income countries 2010-2014: variation by age and stage at diagnosis (the ICBP SURVMARK-2 project). Gut. 2021;70(1):114-126. doi:10.1136/gutjnl-2020-320625 [5] Brahmer JR, Drake CG, Wollner I, et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J Clin Oncol. 2010;28(19):3167-3175. doi:10.1200/JCO.2009.26.7609 [6] Spinelli JB, Yoon H, Ringel AE, Jeanfavre S, Clish CB, Haigis MC. Metabolic recycling of ammonia via glutamate dehydrogenase supports breast cancer biomass. Science. 2017;358(6365):941-946. doi:10.1126/science.aam9305 [7] Bell HN, Huber AK, Singhal R, et al. Microenvironmental ammonia enhances T cell exhaustion in colorectal cancer [published online ahead of print, 2022 Dec 12]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00504-6. doi:10.1016/j.cmet.2022.11.013 本文作者丨渠清源 责任编辑丨代丝雨 |
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