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肿瘤MSI表型在肿瘤治疗中的作用越来越重要，法国Colle教授在Bull Cancer杂志上发文对肿瘤中MSI流病学、检测方法以及对治疗的指导作用做了详细阐述。 人类肿瘤表型微卫星不稳定性（MSI）与误配修复（MMR）基因的失活改变有关。MSI在林奇综合征（LS）相关的遗传性肿瘤、散发结直肠癌、胃癌和子宫内膜癌中均可见到。MSI肿瘤特征是全基因组大量微卫星DNA重复序列的遗传学不稳定。MMR缺陷并不直接促发肿瘤，通过影响功能性DNA重复序列产生致癌作用，MMR缺陷（dMMR）肿瘤里多数原癌基因改变是体突变，是MSI的继发改变。 研究表明某些编码重复序列突变在肿瘤发生过程中具有阳性选择作用，赋予肿瘤细胞生长优势；此外 MSI使肿瘤合成畸变、具有潜在免疫原性的新抗原，导致MSI肿瘤中大量细胞毒T细胞（CTLs）浸润，表达活化标志和Tc1、Th1。CTL/Th1/细胞毒标志增高是CRC独立预测复发和总生存的因素，高密度淋巴细胞浸润是长生存的明确预测因素。 T细胞免疫反应启动需有二个信号：T细胞受体（TCR）识别MHC抗原肽段，受体与抗原递呈细胞（APCs）上的配体相互作用形成共刺激信号。抑制T细胞受体的信号对T细胞活性影响巨大，肿瘤中浸润的T细胞长期过多表达各种负调控免疫节点，如PD-1、LAG-3和TIM-3，导致CD8T细胞功能耗竭，对抗原刺激无反应，不能增殖，无抗癌效应功能，如细胞毒作用和分泌干扰素γ。 这些研究为发展靶向上述分子调节途径的药物提供了依据，这些药物称作节点抑制剂（CKI），理论上能增加抗癌免疫反应。临床研究已证实靶向PD-1/PD-L1的mAb能诱导多种类型肿瘤治疗反应，不过多数肿瘤中只有20%的患者获益，接下来需要明确有治疗反应和无治疗反应患者之间存在哪些差别，发现可用于预测治疗反应的生物学标志。 有报道显示肿瘤表达PD-L1和髓系细胞浸润时疗效更佳，虽然PD-L1是预测抗PD-1/PD-L1的标志，但它并不理想，敏感性和特异性较差。Rivzi观察到肺癌中高突变和有大量新抗原发生时对PD-1 mAb治疗更敏感。 最近研究显示因为免疫逃逸和大量表达CK相关蛋白，MSI肿瘤可能持续处于不良免疫微环境状态。根据这一结果，2015年Le评估了抗PD-1 CKI（帕姆布罗珠）治疗转移性MSI肿瘤的疗效，另一项2期研究评估了纳武单抗（抗PD-1 mAb）±伊普利姆玛（CTLA-4mAb）的疗效，二项研究明确显示MSI状态可以预测CK阻滞治疗的获益，肿瘤是MSI表型时可能对PD-1阻滞治疗获益。 确定微卫星不稳定性和误配修复缺陷 欧洲的LS指南推荐，所有CRC患者均应行免疫组化或PCR方法鉴定是否为LS；Mallorca小组推荐所有CRC均应行免疫组化或PCR检查，而且检查时还要鉴别是否有MLH1启动子甲基化，所有＜70岁的子宫内膜癌都应考虑免疫组化或PCR法检查。2015年ESMO推荐所有CRC患者都要进行MSI和/DNA MMR缺陷检查明确有无LS。 随着PD-1抑制免疫治疗在dMMR CRC中治疗的成功，所有转移性CRCs进行MMR或 MSI评估将成为必需进行的检查。对于肿瘤标本，MSI表型可通过PCR方法检测，也可以通过免疫组化方法检测MMR蛋白缺失，MMR蛋白包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。 1、多聚酶链反应 微卫星是高度重复的1-6个核苷酸DNA序列，分布整个基因组，复制时经常发生错误，MMR系统负责检测修正微卫星复制错误。PCR法检测基因组微卫星是标准的检测MSI方法，百塞斯达指南最初推荐5个微卫星组合标准，包括2个单核苷酸重复序列（BAT-25和BAT-26）和3个双核苷酸重复序列（D2S123、D5S346和D17S250），检测时比较正常组织和肿瘤组织中标志物的长度，MSI表型至少要含有2个微卫星不稳定。 2002年Colle教授小组提出另一组5个单核苷酸重复序列检测MSI，该组标志无需同时分析非肿瘤DNA，该组标志获NCI批准筛查MSI肿瘤，特异性和敏感性更好，2个不稳定标志将肿瘤定义为MSI表型。PCR法检测MSI肿瘤表型的主要缺点是DNA肿瘤标本可被正常组织DNA污染，此外肿瘤含量低也会影响结果，这一点在粘液性肿瘤中尤为突出。 Colle教授小组最近报道MSI CRC 中HSP110（HT17）的T17单核苷核重复序列高频突变，肿瘤DNA缺失HT17重复序列导致HSP110异构体合成增加。研究显示明确是否为MSI时，HT17的敏感性更优，因此HT17 DNA重复序列似乎对诊断CRC MSI表型更优。 2、免疫组化 免疫组化方法可以研究MMR蛋白的表达情况，生理情况下MMR蛋白在核内表达，较多表达于粘膜陷窝下1/3细胞，基质炎症细胞和上皮细胞中。MSI肿瘤细胞的双等位基因失活时，免疫组化方法检查时肿瘤细胞中MMR蛋白表达缺失。 肿瘤细胞核中MMR蛋白呈局限性的较弱染色，如果肿瘤细胞核中完全缺失某个MMR蛋白表达，就认为是表达缺失，此时需内对照阳性（基质炎症细胞和内皮细胞核染色阳性），如果肿瘤细胞和基质细胞均无染色时，应重复检查。有时内对照染色强于阳性的肿瘤细胞，应行分子MSI分析证实是否为有缺陷的DNA MMR系统。 MMR蛋白的异二聚体形成功能体：MLH1与PMS2、MSH2与MSH6分别形成功能性二聚体复合物。MLH1和MSH2蛋白是二聚体的主导蛋白，PMS2和MSH6是配对蛋白，MLH1和MSH2突变可导致二聚体蛋白降解，致主导蛋白和配对蛋白表达缺失。MLH1和MSH2表达缺失相互排斥，只能有一种蛋白表达缺失。如果MLH1蛋白表达缺失，则同时伴有PMS2蛋白表达缺失，同理MSH2蛋白表达缺失导致MSH6同时表达缺失。 如果配对蛋白基因PMS2和MSH6突变，通常也可导致主导蛋白同时缺失，可能是因为与其它MMR系统成分如MSH3、MLH3和PMS1相互作用所致。虽不是绝对，但通常MSH2、MSH6和PMS2的缺失是胚系突变的证据，而MLH1蛋白缺失可能是MLH1胚系突变，也可能是启动子甲基化所致，此外EPCAM组成性3’端缺失（MSH2基因上游）也可表观沉默MSH2导致LS。MSH2表达阴性的患者也可以是MSH2双体突变所致，与LS无关。 免疫组化方法价廉、耗时少，病理科常规用于检测MMR蛋白。该技术很敏感，甚至可用于小肿瘤标本检测，而且可以鉴别受影响的MMR基因，指导胚系突变分析。早期MLH1和MSH2的研究显示，在预测是否为胚系突变方面，免疫组化方法敏感性（85%）低于MSI（93%）。MMR蛋白缺失和MSI检测结果的相关性很好，因此免疫组化方法可用作一线筛查。 免疫组化方法对筛查蛋白截短或降解突变很可靠，假阳性可见于错义突变，它导致蛋白突变，酶促活性消失，但抗原性完整。直肠癌新辅助放化疗后MSH6染色强度降低，因此免疫组化分析治疗前内镜活检标本优于手术标本。此外组织标本固定的异质性也会降低免疫组化技术的敏感性。 Colle教授认为要想获取最佳结果，标本应在10%福尔马林中固定，还应时刻牢记免疫组化技术很难完全标准化，重复性相对差，所以免疫组化应由有经验的病理专家进行，染色结果也应与分子结果相对应。 3.下一代基因测序 NGS已被用作诊断性方法检测MSI肿瘤，主要依据如下假说：多基因组的突变负荷可明确排除pMMR肿瘤。Stadler的研究中对224例CRC患者进行NGS分析，当肿瘤突变不足20（193例）时为pMMR肿瘤。31例≥20个突变CRC中，28例为dMMR，其余3例携带POLE突变，为过甲基化表型，突变超过150（dMMR肿瘤中位突变50）。 然而NGS仍仅限于高度专业的实验室，需要高质量的肿瘤和正常组织标本。Stadler采用多基因组合分析，包括深度测序所有外显子和341个癌症相关基因的内含子，以明确鉴别dMMR肿瘤的NGS基因组合和特异性突变负荷阈值。很快NGS将成为另一种用于区别pMMR 、dMMR和POLE突变肿瘤的方法。 MSI结直肠癌 1、流病学 MSI CRC 具有特异的临床病理特征:近端结肠、分化差、粘液性成分、高水平炎症浸润。MSI CRC约占II和III期CRC的15%-20%，预后优于pMMR肿瘤。II期dMMR CRC不适合使用氟脲嘧啶类化疗，因为这类患者生存期长，化疗作用不大。奥沙利铂类化疗仍是III期CRC标准治疗，无论MMR状态如何。 转移性CRC中dMMR肿瘤只有5%，明显低于II和III期肿瘤，说明dMMR CRC发生转移的能力较差，不过一旦发生转移，dMMR状态与预后差相关，在3063例IV期CRC患者中，dMMR肿瘤患者的无进展生存和总生存差于pMMR肿瘤患者。 dMMR CRC与BRAFV600E突变关系密切，35%的 BRAFV600E突变CRC发生于dMMR mCRC中，21%的dMMR CRC发生于BRAFV600E突变的mCRC。实际上dMMR和BRAFV600E突变在CMS1亚类中最多，CMS1亚类的特征是无病生存长，但复发后快速进展。BRAFV600E突变有助于判断dMMR mCRC预后，此类患者预后不良，部分归因于BRAFV600E突变。 3、散发和遗传性dMMR结直肠癌 标准的免疫组化和生物学标志分析对区分散发dMMR和LS相关肿瘤很有帮助。dMMR CRC伴有MLH2/MSH6或孤立MSH6/PMS2表达缺失时应当认为是LS相关肿瘤，无论BRAF突变状态如何。患者具有MMR组成性突变时可以存在BRAFV600E突变肿瘤。 dMMR CRC伴MLH1表达缺失时既可是散发也可是遗传性，MLH1阴性CRC时应分析BRAF突变状态和MLH1启动子甲基化状态。散发MLH1阴性肿瘤可以是BRAFV600E突变和/MLH1启动子过甲基化，而LS MLH1阴性CRC则是BRAF野生型、无MLH1启动子过甲基化。已有流程用于区分dMMR CRC患者（图1）。另有报道MLH1和MSH2基因可发生双体突变dMMR CRC，非甲基化的MLH1阴性CRC和MSH2阴性肿瘤并不一定就是LS。 
图1鉴定散发CRC和LS相关肿瘤 3、免疫治疗和dMMR结直肠癌 CK抑制是治疗dMMR CRC很有前景的手段。Le的研究结果显示帕姆布罗珠治疗dMMR CRC的客观反应率40%，而pMMR为0%，进一步分析显示dMMR肿瘤客观反应率（ORR）50% ，pMMR为0% ，dMMR组患者的中位无进展生存（PFS）和总生存（OS）尚未达到，而pMMR组只有2.4和6个月。目前3期研究正在比较帕姆布罗珠与化疗一线治疗dMMR mCRC。
dMMR mCRC患者也采用其它CKI治疗评估。纳武单抗是另一个抗PD-1 mAb，单独（N3）或与伊普利姆玛（抗CTLA-4 mAb）联合（N3+I1）治疗dMMR mCRC，疗效良好（100例）。二组的ORR分别为25.5%和33.3%，均获持续治疗反应，只有1例pMMR组患者获部分缓解。N3和N3+I1组的中位PFS分别为5.3个月和尚未达到，中位OS分别为17.1个月和尚未达到。副反应发生率可接受，无论BRAF和KRAS突变状态以及PD-L1是否表达，均有临床疗效。 虽然在MSI肿瘤中尚未发现明确的生物学标志，但MMR缺陷可看作是CKI有效的预测标志，所以转移性dMMR CRC患者应当接受相关检查，因为患者可能有机会接受革新性的免疫治疗。 MSI非结直肠癌 1、流病学 MSI非结直肠癌的流病数据很不完整，子宫内膜癌、胃癌、肝细胞癌、甲状腺癌、黑色素瘤和皮脂腺肿瘤中MSI表型发生率较高，＞10%；卵巢癌、宫颈癌、食管腺癌、软组织肉瘤、头颈鳞癌、肾癌和Ewing's肉瘤也有MSI表型，发生率2%-10%；皮肤鳞癌或基底细胞癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和骨肉瘤中MSI表型＜2%；MSI表型在非霍奇金淋巴瘤中发生率很低。 大约20 %-30%的子宫内膜癌携带MMR缺陷，MSI子宫内膜肿瘤表现为高级别、脉管瘤栓和淋巴侵犯。MSI表型可见于所有卵巢癌亚型中，与预后似乎并无关联，较多见于子宫内膜样和粘液性癌，较少见于浆液性癌（主要与LS相关），LS时dMMR肿瘤多为低级别早期子宫内膜样癌。 MSI胃癌的了解甚少，几项研究显示MSI与较早分期、较大年龄和肠型胃癌有关。尽管MSI表型是免疫治疗疗效的很有前景的生物学指标，不过MSI肿瘤的临床和分子特征仍不甚清楚。 2、免疫治疗和dMMR非结直肠癌 一项2期研究评估帕姆布罗珠治疗非结直肠dMMR转移性肿瘤的疗效，包括子宫内膜癌、壶腹癌、胰腺癌、小肠癌、胃癌、以及其它肿瘤。帕姆布罗珠疗效良好，ORR为53%，9例完全缓解，7例部分缓解，1年PFS率和OS率分别为57%和81%。目前几项研究正在进一步评估免疫治疗疗效，其中部分研究的入选标准要求肿瘤为MSI表型，而无需考虑原发肿瘤类型。 3、组成性误配修复缺陷 MMR双等位基因胚系突变的患者深受组成性MMR缺陷（CMMRD）之苦。这种罕见的综合征（不足200例）与早期发作的肿瘤如CRC、脑瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病有关。CMMRD的特征是MMR缺陷，MSI表型存在于肿瘤细胞和永生的淋巴母细胞中。 CMMRD所致的多形性脑胶质瘤是人类肿瘤中突变负荷最高的肿瘤。患有复发多形性CMMRD 脑胶质瘤的2兄弟接受纳武单抗治疗，疗效显著，治疗反应持久，而该病复发后通常生存不足6个月。CKI有可能成为CMMRD相关肿瘤治疗的突破性进展。 结语 MMR 缺陷是癌症的驱动改变，发生于多种人类肿瘤中，不论是散发还是遗传性起源。MMR缺陷导致MSI表型，可通过免疫组化、PCR和NGS方法检测。免疫CKI治疗MSI/dMMR肿瘤疗效很好，对MSS CRC无效，因此MSI表型和MMR缺陷可作为CKI有效的阳性预测标志。MSI表型发生率高的肿瘤中应强制检查MSI和MMR状态以指导治疗，此外还需对MSI/dMMR肿瘤进行更系统的临床研究。 |
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