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精选签名 不似明燈照，又非暗幕張。 朦朧春月夜，美景世無雙。 摘要
随着分子检测的指数增长，黑色素细胞肿瘤(Melanocytic tumours)的诊断工作在最近几年发生了显著的变化。对于执业的病理学医生来说，通常很难对目前可用于临床的大量不同检测进行分类。
黑色素细胞病理学中使用的分子检测可以大致分为四类: (1)预测对黑色素瘤(melanoma)全身治疗反应的检测。 (2)预测黑素瘤预后的检测。 (3)用于确定黑素细胞肿瘤的类型或种类的检测。 (4)用于痣与黑色素瘤的鉴别诊断的检测(主要用于辅助诊断组织学上不明确的黑色素细胞病变)。 这篇综述将介绍临床实践中使用的主要分子辅助检查的最新概要。
介绍
过去几年见证了分子病理学领域的很大发展。可用于各种肿瘤(包括黑色素细胞病变)的检测的数量和类型呈指数增长。对于外科病理学医生或皮肤病理学医生来说，跟上该领域的快速发展步伐似乎是一项艰巨的任务。尽管存在这些挑战，但由于某些分子发现对诊断、预后和/或治疗具有重要意义，因此目前通常需要在黑色素细胞肿瘤的诊断中使用分子工具。这篇手稿的目的是提炼出临床实践中黑色素细胞肿瘤分子检测的重大进展，并以一种与执业外科病理学家相关的形式呈现出来。
黑色素细胞肿瘤(Melanocytic tumours)的遗传学进展 在过去的十年中，我们对黑色素细胞肿瘤(melanocytic neoplasms)的遗传基础的理解取得了重大进展。 目前的黑色素瘤发生模型认为，肿瘤进展为黑色素瘤是通过以下途径发生的涉及多种细胞途径的遗传改变的多步累积。 该过程通常遵循不连续的步骤，并且在不同阶段可以永久或暂时停止进展，导致黑色素细胞肿瘤，其具有从良性到恶性的可变生物潜能。 现在已经认识到，大多数良性黑色素细胞痣是由前体细胞中发生的单一基因改变引发的，该改变激活了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径。这种单一的起动事件导致有限的克隆扩增，并且不足以恶性转化，因为细胞保护措施防止了不受控制的生长。 在过去几年中，已经发现一些黑色素细胞肿瘤，以前被归类为痣或交界性肿瘤，除了在痣中看到的 MAPK 途径改变之外，还隐藏一个或几个额外的致癌事件，导致具有额外改变的细胞在形态学上独特的克隆扩增。在修订的世界卫生组织分类中，这些病变现在被归为黑色素细胞瘤(Melanocytomas)，以承认在分子水平上它们在从痣到黑色素瘤的进展序列中占据中间位置。黑色素细胞瘤通常是组合病变，具有携带初始改变的痣和表现出额外基因组事件的表型不同的黑素细胞群。大多数黑色素细胞瘤具有惰性的生物学行为。它们可能扩散到局部淋巴结。然而，远距离转移是非常罕见的。由于它们的遗传特征，与痣相比，黑色素细胞瘤转化为黑色素瘤的风险更高。然而，转化的绝对风险尚不可知。
相比之下，黑素瘤的特征在于影响几种生物途径的多种增殖。黑素瘤可以通过额外的逐步遗传和表观遗传改变在痣或中间黑素细胞瘤中出现，但大多数是重新出现的，没有相关的前驱病变。导致黑色素瘤的改变通常涉及阻止不受控制的复制的途径的破坏，如CDKN2A、PTEN、TP53或NF1基因的失活，TERT启动子(TERT-D)突变和其他癌基因如RAC1、ERBB2、MAP2K1、EGER或MET等的激活。检测这些基因变化，如TERT-p突变或CDKN2A同源缺失，可以用来区分痣和黑色素瘤。
黑色素瘤中遇到的基因改变谱变化很大，主要取决于解剖部位、年龄或特定良性前驱病变的存在。这种变异可能是诱变过程、原始细胞状态和微环境之间相互作用的结果。
目前的黑色素瘤分类认可皮肤和粘膜黑色素瘤发展的八种途径，其中一些与良性和中间(黑色素细胞瘤)前体相关(表1) 途径1包括低度日光损伤(low cumulative sun damage，CSD)相关型黑色素瘤或浅表播散性黑色素瘤。良性的先兆表现为携带BRAF 或不太常见的NRAS 基因突变的普通痣。与该途径相关的黑色素细胞瘤(及其定义的继发性改变)包括深部穿通性痣( Deep penetrating naevus ，DPN)(CTNNB1或APC基因突变)、色素性上皮样黑色素细胞瘤(PRKARIA基因失活)和BAP1失活的黑色素细胞瘤(BAP1基因失活)。 途径2(高CSD黑色素瘤或恶性雀斑型黑色素瘤)。 途径3(促结缔组织增生性黑色素瘤)。 途径5(肢端型黑色素瘤)。 途径6(粘膜黑色素瘤)与良性痣无关(肢端型黑色素瘤有一些罕见的例外)，中间阶段以原位黑色素瘤为代表。 途径4包括Spitz黑色素瘤，Spitz痣为良性病变，非典型Spitz肿瘤(Spitz 黑色素细胞瘤)为中间前驱病变。涉及几个酪氨酸和丝氨酸-苏氨酸激酶基因的HRAS突变和重排与Spitz 痣相关。 途径7对应于先天性色素痣引起的黑色素瘤，NRAS基因突变引发驱动改变，增生性结节作为中间黑素细胞瘤病变（以整个染色体的拷贝数改变为特征）。 途径8指的是发生在蓝痣中的黑色素瘤，非典型细胞蓝痣作为中间黑色素细胞瘤。良性蓝痣的特征是 GNAO 和GNA11中的激活突变，CYSLTR1和PLB4基因中很少。这些病变中的BAP1失活提示恶性转化并预示着不良预后。
表1皮肤和粘膜黑色素瘤的途径分类
ACBN，非典型细胞性蓝痣；AST，非典型Spitz肿瘤；BIMT，BAP1失活黑素细胞肿瘤；CSD，累积太阳损伤；DPN，深部穿通性痣；MIS，原位黑色素瘤；PEM，色素性上皮样黑素细胞瘤。
ACBN, atypical cellular blue naevus; AST, atypical Spitz tumour; BIMT, BAP1-inactivated melanocytic tumour; CSD, cumulative sun damage; DPN, deep penetrating naevus; MIS, melanoma in situ; PEM, pigmented epithelioid melanocytoma 黑色素瘤的分子检测
在我们对黑色素细胞肿瘤的分子基础的理解上的这些显著的进步导致了一个广泛的分子检测的谱系旨在描述它们的特征。在分子水平上评估黑素细胞损伤目前不仅仅是学术研究，而且已经进入临床实践，因为特定的分子发现对诊断、预后和治疗有影响。这些检测可以大致分为四类:(1)预测对黑色素瘤全身治疗反应的检测:(2)预测黑素瘤预后的检测:(3)用于确定黑素细胞肿瘤的类型或类别的检测:和(4)用于痣与黑色素瘤的鉴别诊断的检测(主要用于辅助诊断组织学上不明确的黑色素细胞肿瘤)。
用于预测全身治疗反应的检测
用于预测对全身治疗的反应的分子检测通常适用于晚期黑色素瘤，在这种治疗中是有指征的。目前，有两种用于黑色素瘤的全身疗法:使用BRAF和MEC抑制剂阻断MAPI途径的靶向治疗剂，以及调节针对黑色素瘤细胞的免疫反应的免疫检查点抑制剂疗法。靶向治疗的有效性取决于 BRAF 基因突变的存在。事实上，靶向治疗在BRAF 野生型病例中可能是有害的，在这些病例中，BRAF抑制剂的使用可导致MAPK途径的反常激活。因此，对于任何考虑使用BRAF抑制剂治疗的黑色素瘤，都应该评估BRAF基因状态。目前，二代测序方法正在取代用于 BRAF 测序的经典Sanger 分析;然而，检测突变的BRAF V600E蛋白的免疫组织化学染色是可用的，这对执业外科病理学医生特别重要。该染色剂可用于评估小肿瘤或混有非黑素细胞的肿瘤，对于这些肿瘤，通过常规方法测序可能是困难的。BRAF 免疫组织化学显示了与测序数据的良好相关性。黑色素瘤中另一种常见的改变涉及 NRAS 基因，约20-30%的非肢端黑色素瘤会出现这种改变。迄今为止，还没有针对NRAS 突变黑色素瘤的成功的特异性治疗;然而，MEK联合细胞周期蛋白依赖激酶4/6的检测(CDK4/6)抑制剂正在研发中。较少见的是，KIT基因突变可在少数黑色素瘤中发现，在粘膜和肢端型黑色素瘤中更常见，这些患者可能受益于KIT抑制剂靶向治，对免疫抑制剂的反应更难预测；然而，这是很重要的，因为这些药物有显著的副作用。对免疫抑制剂治疗的反应似乎与肿瘤向免疫系统呈递的外源抗原的量相关，而外源抗原的量又与肿瘤突变负荷相关(TMB）。评估TMB的检测目前正在使用，高TMB与免疫治疗的更好反应相关。最近使用转录组（基因表达）数据的预测模型，如免疫治疗预测评分（IMPRES），正在被研究作为对免疫检查点抑制治疗反应的潜在有用的预测因子。
预测黑色素瘤预后的检测
这些检测旨在预测转移至局部淋巴结的风险和/或黑色素瘤的总体疾病特异性存活率。目标是更好地将患者分为不同的风险组，并潜在地选择一个不需要前哨淋巴结(SLN)活检的低风险组。该检测采用与黑色素瘤生物学相关的选定基因组的基因表达谱(GEP)和各种概率算法来产生SLN阳性和/或疾病进展的风险估计。这些分析中的一种是 31-GEP(决定x-黑色素瘤:美国卡斯尔生物科学公司)。这是一种商业检测方法，可将低风险(1级)和高风险(2级)皮肤黑色素瘤进行分层。最近评估该分析的研究得出结论，在单变量分析中，它以合理的准确度预测了区域和远处转移的风险:然而，只有一项研究报道了多变量分析，解释了一些与黑色素瘤特异性存活相关的已知临床病理变量。为了提高性能，开发了一种SLN阳性的组合预测模型，该模型结合了GEP 的临床病理数据。结果显示对T1/T2肿瘤，SLN活检减少率可达 40%。 欧洲开发的GEP 模板(MelaGenixNeracare，German)将来自11基因小组的基因表达风险评分与SLN状态相结合，并被证明可改善已知 SLN状态患者的无复发生存率预测。 这些检测有可能改善黑色素瘤患者的管理;然而，到目前为止，还不清楚他们是否在传统的分级参数之外增加了什么。
有助于确定黑色素细胞肿瘤类型或类别的检测
目前，诊断黑色素细胞病变的金标准仍然是组织学检查。然而，有某些类型的黑色素细胞肿瘤表现出重叠的组织学特征，其中明确的分类有时可能具有挑战性。近年来，已经变得明显的是，各种类型的黑素细胞病变的特征在于特定的分子事件，这些事件现在是二维分类的一部分(表1)，当病理学特征无法诊断时，这些特异性改变可用于辅助黑色素细胞病变的分类。大多数这些改变代表了导致痣形成的初始驱动事件或导致黑色素细胞瘤的继发性事件。因为由这些痣或黑色素细胞瘤演变而来的黑色素瘤携带同样的异常，它们的存在往往不能用于预测恶性潜能。
对于外科病理学医生来说，重要的是认识到这些基因组事件中的一些可以使用免疫组织化学染色进行评估，包括BRAFV600E、NRASQ61R、β-catenin、BAP1、PRKAR1、ALK和pan-TRK(Table 2)。这些检测可能有助于区分深部穿通性痣(DPN)与细胞性蓝痣(CBN)和 Spitz 痣，区分BAP1 失活的黑色素细胞瘤(BIMT)与Spitz肿瘤，或诊断色素性上皮样黑色素细胞瘤(PEM)。
表2特异性IHC染色有助于确定黑色素细胞肿瘤的类型
AST，非典型Spitz肿瘤；BIMT，BAP1失活的黑素细胞瘤；DPN，深部穿通性痣/黑素细胞瘤；LOH，杂合性缺失；PEM，色素性上皮样黑素细胞瘤；PSCN，色素性梭形细胞痣；SSM，浅表扩散性黑色素瘤。 AST, atypical Spitz tumour; BIMT, BAP1-inactivated melanocytic tumour; DPN, deep penetrating naevus/melanocytoma; LOH, loss of heterozygosity; PEM,pigmented epithelioid melanocytoma; PSCN, pigmented spindle cell naevus; SSM, superficial spreading melanoma. DPNs 现在被认为是黑色素细胞瘤，其特征是通过BRAF、MAP2K1或HRAS的突变激活MAPK通路，以及编码β-catenin的CTNNB1基因或APC基因的第二个激活突变。β-catenin的细胞核和/或细胞质染色的存在，而不是膜染色，高度提示CTNNB1突变，并支持诊断DPN与其他实体的鉴别，如Spitz病变的CBN(图1A- E)。
BIMT 是另一个与 Spitz 病变鉴别诊断的黑色素细胞瘤的例子，它显示了包括一个活化突变在内的基因组改变MAPK途径，通常是BRAF突变结合BAP1基因失活。BRAFV600E和BAP1的免疫组织化学可用于记录病变细胞核中BAP1染色的缺失和BRAF 的表达(图1I–L)。相反，Spitz肿瘤的特点是激酶基因的HRAS 突变或融合。免疫组化染色可用于这些融合产物，包括ALK和pan-TRK，并可作为重排存在的替代物(图1F–H)。
图1用于黑色素细胞病变分类的免疫组织化学染色(IHC)实例。(A-E)非典型深部穿通性痣(DPN)。(A)涉及深层真皮的联合黑素细胞增生。(B)普通皮内痣存于真皮上部。(C)上皮样细胞和梭形细胞，具有丰富的苍白色细胞质、核异型性和代表非典型 DPN 成分的大量黑素吞噬细胞。(D) BRAFV600E IHC 显示两种成分弥散染色。(E)β-Catenin IHC在DPN(右下侧)显示异常的胞质和细胞核染色提示这种类型黑色素细胞瘤特征性的CTNNB1基因中存在激活突变。普通痣的正常膜染色(左上侧)。(F-H)非典型 Spitz肿瘤伴 ALK 基因重排。(F)息肉状真皮黑素细胞增生，边缘可膨胀，生长紧密，但未成熟。(G)上皮样和梭形梭形细胞，具有紧密成束排列的 spitzoid形态。(H)ALK·IHC 呈弥漫性阳性，提示存在涉及 ALK 基因的重排。(I–L)BAP1-失活的黑素细胞肿瘤。(I)大的，主要是皮内肿瘤，具有双表型形态。(J)在浅表部分发现普通的痣成分。(K)上皮样细胞，具有大的细胞核、突出的核仁和丰富的嗜酸性细胞质，具有明显的细胞膜。(L) BAP1 IHC 显示上皮样成分中核染色的丢失(右下侧)和普通痣中保留的标记(左上侧)。
PEMs 是一种皮肤增生，其特征是具有明显色素沉着细胞质的上皮样细胞。PEM其特征是激活MAPK途径的改变和涉及PRKAR1A基因功能丧失的第二种改变。在一部分病例中，PRKAR1a蛋白通过免疫组化显示表达缺失，该染色可用于诊断它们。
BRAFV600E和NRASQ61R 染色有助于鉴别非典型 Spitz痣与具有 spitzoid形态的浅表播散性黑色素瘤(spitzoid黑色素瘤)。在具有spitzoid形态的黑素细胞病变中，BRAFV600E或NRASQ61R的表达有助于将其归入分类的途径1(低CSD/SSM)而不是途径4(Spitz肿瘤)。通常，对于途径4中的低风险Spitz病变而言，可接受的细胞学和结构异型性的程度令人担忧，并且与途径1中的黑色素瘤更加一致(图 2)。
图2 (A)广泛的复合黑素细胞增生。(B)黑素细胞具有 spitzoid形态，呈巢状排列，具有垂直和水平排列，以及少数单个细胞，偶尔呈 pagetoid分布。可见Kamino小体(黑色箭头)。鉴别诊断包括黑色素瘤与非典型 Spitz 痣。(C) BRAFV600E IHC 呈弥漫性阳性。BRAFV600E 突变的存在与 Spitz 肿瘤不相容，诊断为具有 spitzoid 形态的浅表扩散性黑色素瘤。
用于痣与黑色素瘤鉴别诊断的检测
通过常规显微镜检查，大多数黑色素细胞肿瘤可以可靠地分类为痣或黑色素瘤。然而，有一小部分重要的黑色素细胞肿瘤，仅使用组织病理学标准和常规免疫组织化学方法无法明确诊断为良性或恶性，并且通常使用提示其生物学潜能不确定的术语来命名。这些病例通常在会诊中送来的;然而，即使在诊断它们的专家中也存在不同的可重复性，这可能导致管理不当，包括治疗不足或过度治疗。本节讨论的检测通常用于临床，以帮助完善组织学上不明确的黑色素细胞肿瘤的诊断和生物学潜能的判断。在这篇综述中讨论的检测中，它们可能是对执业病理学家最有用的。
基于基因组拷贝数异常评估的分子检测
早期研究发现，黑色素瘤的特征是基因组不稳定，具有大量拷贝数异常(CNA )，而痣缺乏或具有有限数量的CNA。这种基因组异常的模式导致了基于CNAs 评估的诊断策略的发展。目前用于此目的的检测是比较基因组杂交(CGH)/单核苷酸多态性(SNP）阵列和荧光原位杂交(FISH)。
比较基因组杂交/单核苷酸多态性阵列
CGH是通过在微阵列上杂交肿瘤 DNA 来进行的，并评估CNAs的整个基因组。该阵列由可变数量的点(从几千个到超过4百万个)组成，这些点包含来自待检查的特定基因组座位的DNA 阵列的分辨率与点的数量成正比。SNP 阵列检查以特定 SNP 为中心的基因组位点，并且可以检测特定的等位基因。除了拷贝数的变化，SNP 阵列检测杂合性丢失(LOH)事件。对福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的小活检组织进行CGH/ SNP 阵列测试，通常会产生少量降解的DNA，这对大多数平台来说都是一个挑战。诸如基于分子倒置探针(MIPs)的新方案已经提高了分析降解DNA的能力。探针（MIPs）提高了分析降解DNA的能力。MIPs是一种工程寡核苷酸，末端与SNPs侧翼区域互补，足迹仅40 bp，可以评估FFPE组织的DNA片段。该技术的一个优点是，将所有未使用的MIPs和目标DNA从反应中去除，并将MIP上的一个工程标签序列与阵列杂交，大大提高了传统CGH/SNP阵列的信噪比。
图3c显示了典型的SNP 阵列输出。上图显示了每个SNP的拷贝数变化，纵轴为拷贝数或肿瘤与正常的对数比，横轴为染色体，以从p-ter到g-ter的升序扫列。DNA的增加或减少通过高于或低于正常二倍体状态的平均线的偏移来反映。下图显示了每个SNP的等位基因峰值或B等位基因频率状态。对于正常的二倍体状态，该组有三个轨迹，一个由所有杂合 SNP 组成的中间线和两个包含任一等位基因的纯合 SNP的外部线。杂合性缺失通过中间杂合系的分裂来反映。通常，LOH是伴随着DNA的损失或获得:然而，也可以检测到没有相关拷贝数异常的杂合性缺失事件(拷贝中性杂合性缺失)Bastian等人的初步工作证明CGH检测可用于区分痣和黑色素瘤。 在他们的研究中，作者发现黑素瘤和痣中CNAs的频率有显著差异(分别为96.2%和13%)。黑色素瘤表现为多个CNAs，涉及染色体片段，而少数伴有CNAs的痣只有孤立的异常。使用SNP和CGH阵列的后续研究证实了这些结果，89.0-947%的黑色素瘤显示CNAs，而94.7-100%的痣具有正常的染色体特征。
图3用SNP 阵列测试的低风险非典型 Spitz 肿瘤的例子。(A)主要是真皮黑素细胞增生，显示出致密生长和缺乏成熟。(B)上皮样和梭形细胞，具有spitzoid形态、紧凑的生长模式和细胞学非典型性。(C) SNP 阵列结果。上图显示拷贝数状态(纵坐标为对数比，横坐标为染色体基因座)。增益和损失分别通过平均黄线在 0 以上或以下的偏移来反映。黑色箭头表示染色体 1p、5p 和整个 9 号染色体的一个拷贝数丢失。下图显示了阵列上每个 SNP 的 B 等位基因频率(B 等位基因频率在垂直方向上，染色体基因座在水平方向上)。在正常状态下，该轨道由三个系组成，一个中间杂合系和两个外部系，它们对于 A 和 B 等位基因是纯合的。红色箭头表示与丢失相关的染色体 1p、5p 和 9 上的 LOH 事件。在这种情况下，三个 CNA 的存在低于四个的临界值，有利于降低不良结果的风险。
CGH/SNP阵列的性能也已经针对黑素细胞肿瘤的特定亚型进行了评估，这些亚型是众所周知的仅通过常规显微镜难以分类为良性或恶性的，包括 Spitz 和蓝痣样肿瘤，Spitz 肿瘤组由 Spitz 痣(良性)、非典型Spitz肿瘤(交界性/黑色素细胞瘤)和 spitzoid 黑色素瘤(恶性)组成。已经表明，Spitz 痣没有异常或孤立的CNA包括11p或7p的增益，而 spitzoid 黑色素瘤显示多个CNAs涉及染色体的部分片段。蓝痣组由细胞性蓝痣(CBN)(良性)、非典型 CBN(交界性/黑色素细胞瘤)和发生于或类似CBN的黑色素瘤(恶性)组成。几项研究已经证明CBN、非典型CBN和黑色素瘤之间的染色体异常的非重叠模式，蓝痣中的黑色素瘤表现出多种染色体异常，而CBN和非典型CBN没有CNA或CNA数量有限(<3)。
从最初的研究来看，二分法似乎可以用于诊断痣和黑色素瘤。然而，最近的研究记录了CNA 的数量逐渐增加，与黑色素细胞肿瘤从良性到交界性、黑色素瘤和转移性黑色素瘤的进展平行。Alomari等人最近的一项研究发现，CNA的平均数量从痣中的0增加到非典型痣中的0.6、交界性病变中的2.8和黑色素瘤中的18.1。 很明显，有些痣或黑色素细胞瘤携带一个或几个CNA，但表现出良性或惰性的生物学行为。这些异常不像黑色素瘤那样是基因组不稳定的结果，而是反映了特定类型黑色素细胞的DNA重排。分离的CNAs可出现在Spitz痣中，其特征为导致基因组重排的驱动因子改变。具有HRAS基因突变的Spitz痣细胞亚群显示11p 的增益(HRAS位点)。在这种情况下，可能显示非典型的组织学特征，在没有其他异常的情况下出现11p 增益支持痣(图4A-C)。另一组Spitz 肿瘤包括Spitz 痣，但也包括非典型Spitz肿瘤和Spitz 样黑色素瘤含有酪氨酸和丝氨酸苏氨酸激酶融合，包括ROS1、NTRK1、NTRK3、ALK、BRAF、MET和RET作为起始驱动突变， 这些异常可以在 CGH/SNP 阵列上表始驱动突变。现为涉及该基因位点的孤立 CNA。孤立的CNA也可发生在低级别黑色素细胞瘤中，作为额外遗传改变的表现。其中一个例子是BAP1失活的黑素细胞肿瘤。这些病变是在先前存在的痣中发生的，其中一个克隆获得第二次异常，导致BAP1基因失活，通常是通过突变和对侧等位基因的缺失，从而导致典型上皮样形态学特征。在CGH/SNP阵列上，这些肿瘤的特征在于包含 BAP1 基因座(3p21)的3号染色体上的缺失(图4D-F)。先天性色素痣中的增生性结节（Proliferative nodules arising in congenital naevi）是黑色素细胞瘤的另一个例子，通常很难与黑色素瘤相鉴别。 通过CGH/SNP 阵列，增生性结节通常显示整个染色体的 CNA(获得或丢失 (图4G–I)。
图4 良性痣或惰性黑素细胞瘤/黑素细胞瘤中特异性 CGH/SNP 阵列异常。(A–C)促结缔组织增生性 Spitz 痣。(A)真皮内黑素细胞增生，伴有明显的促结缔组织增生基质反应和浸润性生长模式。(B)上皮样细胞，细胞核大，核仁明显，有丰富的两性细胞质。(C) SNP 阵列显示 11p 的增益(黑色箭头),没有其他异常，提示为促结缔组织增生性 Spitz 痣。(D–F)BAP1-失活的黑素细胞肿瘤。(D)具有双表型形态的大的、主要是皮内的肿瘤。(E)上图:与普通痣一致的具有色素细胞质的平淡细胞巢。下图:上皮样细胞，细胞核大，核仁明显，富含嗜酸性细胞浆，细胞膜清晰。(F) SNP 阵列显示 3p21 的缺失(红色箭头),没有其他异常，表明是低风险的 BAP1 失活的黑素细胞肿瘤。(G–I)先天性痣中出现的增生性结节。(G)由密集的黑素细胞组成的多细胞真皮结节。(H)紧密排列的梭形黑素细胞，细胞质色素。(I) SNP 阵列，其显示了整个染色体 1、6、8、15、16、18、20 和 22 的增益，暗示了增生性结节(黑色箭头)。
考虑到低风险黑色素细胞病变可能隐藏有限数量的CNAs，重要的是建立CNAs 数量的临界值，超过该临界值，则黑素细胞肿瘤与黑素瘤有关。在Alomari 等人的项研究中，作者提出SNP 阵列检测显示三个或更少的CNAs 应被解释为低风险黑素细胞病变的原因。也有一些例外:涉及黑色素瘤进展中重要基因的异常，如 CDKN2A基因的纯合性缺失，甚至是在孤立的CNAs中也与黑色素瘤有关。相反，具有四个或更多CNA的CGH/SNP 阵列对于高风险黑素细胞病变是令人担忧的(图3 和5)。同样，也有例外，因为增生性结节可能显示整个染色体的多重获得和/或丢失。使用这个临界值，作者报道了诊断黑色素瘤的敏感性和特异性分别为82.5%和100%。
由于该检测通常用于交界性黑素细胞病变，因此评估该组肿瘤中CNAs 的数量和模式是否与临床结果相关是很重要的。这些研究更难进行，主要是由于长期随访和不良事件的病例数量有限。Alomari 等人报道，与有不良事件的患者相比，无不良事件的交界性黑素细胞肿瘤中 CNA的数量较低(分别为3.7和8.5);然而，案例数量相对较少。另一项具有部分随访数据的蓝痣肿瘤研究显示，所有三例有不良事件的病例均显示异常(100%灵敏度)，而六例无不良事件的病例中有三例未显示任何 CNAs (50%特异性)。 需要进一步的研究来更好地确定与组织学不明确的黑色素细胞肿瘤预后不良相关的异常的数量和模式。
荧光原位杂交
CGH/SNP 阵列检测对肿瘤细胞的数量和纯度有一定的限制。该技术需要 10个未染色的载玻片和25%以上的肿瘤纯度才能产生可靠的结果。非常小的、浅表的或伴有严重炎症浸润的黑素细胞增生有时不适合 CGH/SNP 阵列分析。此外，周转时间(TAT)通常为一至数周。FISH已经成为一种替代方法，其优点是只需要很少的切片，允许分析低肿瘤含量的病变，并且TAT短(通常几天到一周)。
该检测最初是根据CGH研究的数据开发的，通过评估针对黑色素瘤中经常受影响的基因组区域的FISH探针。 实现最佳灵敏度和特异性的最少探针数量选择区分黑色素瘤和痣。最佳组包括四个探针，分别针对6p25(RREB1)、6q23 (MYB)、11q13(CCND1)和着丝粒6，诊断黑色素瘤的灵敏度和特异性分别为 86.7%和95.4%。6p25和11q13的增益和6q23的缺失超过临界值被认为是阳性结果，有利于黑色素瘤或高风险黑素细胞病变的诊断（图5D）。后来的研究对不同的痣和黑色素瘤队列进行了评估，发现了相似的结果，敏感性和特异性分别为75-100%和89-100%。与CGH/ SNP阵列类似，评估该试验在预测组织学上不明确的黑素细胞肿瘤的临床结果方面的性能是很重要的。在Gerami等人最初的研究中，我们分析了一组随访的不明确的黑素细胞肿瘤，该检测的敏感性和特异性分别为100%和71%。Massi 等人获得了类似的结果，而Geiser等人的研究显示了较低的灵敏度和特异性，分别仅为 60%和33%。
随后的研究评估了包括额外探针的效果，因为最初的探针组显示出对梭形和 spitzoid黑色素瘤的敏感性较低。结果表明，添加9p21 (CDKN2A)和8q24 (MYC)探针增加了对spitzoid黑色素瘤的敏感性。使用这种扩展的探针组对一系列交界性非典型 Spitz 肿瘤进行了大规模研究，并有随访数据。该研究发现，在诊断具有不良事件的非典型 Spitz 肿瘤时，该分析的灵敏度和特异性分别为100%和76%。
图 5 细胞性蓝痣中出现的黑色素瘤。(A)突入皮下组织的真皮黑素细胞增生。在病变的上部可以看到更多的细胞结节。(B)高倍镜显示卵圆形黑素细胞，苍白色细胞质排列成相互连接的束，并伴有与细胞性蓝痣一致的黑素吞噬细胞。(C)高倍镜下细胞结节显示致密的非典型性细胞。(D)用来自细胞结节的 6p25 (RREB1)探针进行 FISH。大多数细胞核显示两个以上与阳性结果一致的探针信号(红色)。(D)来自细胞结节的黑色素瘤的 SNP-阵列图，显示了与阳性结果一致的染色体片段的大量获得和丢失(黑色箭头)。诊断为细胞性蓝痣所引起的黑色素瘤。
TERT启动子突变
端粒酶逆转录酶（TERT）编码端粒酶的催化亚基，这种酶通过在端粒末端添加核苷酸重复序列来防止端粒磨损导致的细胞衰老。Horn 等人描述了首次在黑色素瘤易感家族中发现种系TERT 启动子(TERT-p)突变，并在74%的研究黑色素瘤细胞系和33%的原发性黑色素瘤中发现紫外线诱导的突变。后来的研究表明，22-78%的非肢端型黑色素瘤携带TERT-p突变，相比之下，肢端型黑色素瘤的TERT-p突变发生率较低（4.2-19%的病例）；然而，它们表现出频繁的TERT拷贝数增加和扩增。
TERT-p 突变不发生在大多数痣。然而，一项研究发现，14个痣中有两个以非常低的等位基因频率(0.2%)携带TERT-p突变(特异性为85.7%)，这表明突变亚克隆的存在可能代表了向黑色素瘤转化的早期病灶。 另一项研究发现，77%归类为中间型或原位黑色素瘤的黑色素细胞病变中有 TERT-p突变，但良性病变中没有。这似乎表明TERT-p的改变发生在黑色素瘤发展的早期。
几项研究评估了TERT-p突变状态作为辅助诊断工具来区分痣和黑色素瘤的可行性。Thomas 等人在一项对86例黑色素瘤、72例痣和40例不确定黑色素细胞增生的研究中报道，黑色素瘤、痣和不确定黑色素细胞增生的TERT-p突变率分别为77.9%、1.4%和5%，诊断黑色素瘤的敏感性、特异性和总准确性分别为77.9%、98.6%和87.3%。相比之下，Roh等人在韩国黑色素瘤队列中发现，分别只有 33.3%和22.2%的CSD和低CSD肿瘤出现TERT-p 热点突变。在同一项研究中，肢端型黑色素瘤中TERT-p 突变的频率为10.9%。在一项评估TERT-p 突变在区分复发性痣和复发性黑色素瘤中的应用的研究中，作者发现敏感性为44%，特异性为 100%，而在痣和黑色素瘤的对照组中，敏感性和特异性分别为65%和90.5%。一项研究将TERT-p突变与一系列56例非典型Spitz 肿瘤和Spitz 样黑色素瘤的结果相关联。作者在所有四个有致命结果的患者中发现了TERT-p突变，但是没有一个患者有良好的临床病程，敏感性和特异性为 100%。
基因表达谱(Gene expression profile，GEP)
GEP包括提取 RNA，将其逆转录成cDNA，并进行实时PCR。从大规模基因表达研究中选择一组在痣和黑素瘤中差异表达的基因，并在痣和黑素瘤队列中验证。目前可商购的组之一由23个基因组成，包括一个与黑色素瘤肿瘤形成相关的基因(PRAME)，八个参与免疫信号传导的基因(CCL5、CD38、CXCL10、CXCL9、IRF1、LCP2、PTPRC 和SLL)，五个多功能基因(S100A9、S100A7、S100A8、S100A12和PI3)和九个管家基因。基因表达水平被转换成一个分数，使用一种专有的加权算法，将恶性病例（＞0）与良性病例（＜-2）分开。介于-2和0之间的分数被认为是不确定的。在最初的验证研究中，该试验对黑色素瘤的诊断的敏感性和特异性分别为90-93%和91-96%。一项独立研究发现，在一系列明确的痣和黑色素瘤中，敏感性较低，仅为62%，特异性为95%，与FISH结果的相关性为80%。另一种市面上可获得的GEP 检测基于35个基因组(32个鉴别基因和3个对照基因)，并采用专有的神经网络算法来对病例进行分类。 GEP检测可能作为棘手的黑素细胞肿瘤的辅助检测；然而，需要更多的研究将检测结果与不明确的黑素细胞病变的结果联系起来。
讨论
黑素细胞病理学领域经历了分子检测的数量和可用性的实质性增长。外科医生和肿瘤学医生通常使用与黑色素瘤的预后和治疗相关的检测:然而，用于诊断和分类的分析有助于处理棘手的黑素细胞病变，因此与外科病理学医生和皮肤病理学医生相关。
临床实践中最有影响力的检测是那些在组织学不明确的情况下帮助区分黑色素瘤和痣的检测。一些检测可用于诊断目的，包括CGH/SNP 阵列、FISH、GEP和TERT- p突变分析。
在众多可用的检测中进行选择可能是一项困难的任务，病理学医生了解每种检测的优点和局限性是很重要的。CGH/SNP阵列和FISH是临床使用历史最长的检测。CGH/SNP阵列和FISH测试通常由大型参考实验室或学术机构提供。如果可能的话，CGH/SNP 阵列通常是优选的检测，因为它覆盖了整个基因组，与只检测几个选择的基因座的 FISH相比，具有更高的灵敏度。CGH/SNP 阵列也可能更特异，因为在四倍体背景下可能出现假阳性FISH结果，尤其是在Spitz 痣中。最近一项比较FISH和CGH/ SNP 阵列测试的研究发现，与CGH/SNP阵列相比，对于交界性黑素细胞病变，FISH的灵敏度仅为 61%，特异性为84%。此外，FISH结果的准确性也依赖于计数信号的人的经验，这对于CGH/SNP 阵列检测来说不是问题。尽管有这些限制，但也有一些情况是首选FISH。只有在有限数量的标本可用或当肿瘤被其他类细胞浸润时的情况可能不适合 CGH/SNP 阵列，但适用于FISH。此外，FISH具有较低的 TAT 和较便宜。23-和35- GEP的检测方法已在商业上出售（myPath黑色素瘤和DiffDx-黑色素瘤；城堡生物科学）。这些检测是有希望的；然而，在提出明确的建议之前，还需要更多的经验。TERT-p突变在大多数分子实验室可以很容易地进行，因此更广泛地应用。TERT-p突变状态可以区分明确的痣和黑色素瘤；然而，在一些研究中，检测黑色素瘤的敏感性相对较低。与GEP类似，TERT-p测试相对较新，在提出明确的建议之前还需要更多的研究。
虽然这些检测在临床实践中的作用仍在改进中，但伊曼纽尔等人对一组皮肤科病理学医生进行的一项研究显示，绝大多数（92%）使用分子检测来诊断具有挑战性的黑素细胞病变（54%报告常规使用，34%报告罕见使用）。在最近的两项评估皮肤病理学中分子检测的适当使用标准的研究中，17名专家被要求对这些检测在各种临床情况下的适当性进行评估。结果显示，CGH/SNP阵列和FISH被认为适用于组织学不明确的黑色素细胞肿瘤，正如所预期的，当组织学可以提供明确诊断，没有使用指征。由于缺乏足够的证据对GEP和TERT-p突变检测的使用没有达成共识。决定何时采用诊新性分子测试以及如何在临床实践中使用结果并不总是简单明了的。最近的一项研究提出了在黑色素细胞肿瘤的诊断中整合分子研究的算法(图6)一来说，分子检测应仅与组织学和临床表现结合使用，其结果应用于支持最初的组织学印象。如果常规显微镜检查和常规免疫组织化学染色可以明确诊断，则不需要额外的分子检测。对于难以确诊的交界性黑素细胞病变，应努力将其分为三类:(1)良性，(2)交界性，或(3)恶性。分类应基于所有可用的数据，包括组织学、免疫组织化学以及人口统计学数据和临床表现:但是，它本质上是主观的。此时，将进行分子检测。如果病变属于1类或2类，并且检测结果为阴性，则可以做出痣/低风险肿瘤的诊断。如果病变为第2类或第3类，且检测呈阳性，则可以诊断为黑色素瘤/高风险肿瘤。对于结果不一致的病例，对于1类检测阳性或3类检测阴性的病例，应将病变作为交界性，检测视为无贡献。
图 6 在黑色素细胞肿瘤诊断中整合组织学和分子数据的算法。
结论
在过去的十年中，黑色素细胞病变的分子评估取得了重大进展，提高了诊断的准确性。然而，需要更多基于结果的研究来更好地定义和改善这些交界性黑素细胞肿瘤检测的性能。
参考 Molecular testing in melanoma for the surgical pathologist Aleodor A Andea. Pathology. 2022.
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