|
华丽的外表千篇一律，有趣的事情取其一例，笔者今天撰写的事情是关于Miseq上机文库怎样稀释均一化的方法，也就是把我们建库实验操作所得到的ng/ul的文库，转化为满足Miseq测序仪上机要求nmol浓度的方法。 至于我们为什么要去把ng/ul的浓度转化为nmol呢，当然是为了配合Miseq测序仪的需求啦~ 首先讨论下，为什么我们要用数量单位（nmol）去均一化文库，而不是用质量单位（ng/ul）呢？ 数量单位，比如拷贝数，摩尔浓度等，指的是分子的个数。 质量单位，比如ng/ul，指的是一定体积里分子的质量。 从illumina的测序原理上看，其测序芯片上预制了很多小抓手（芯片接头）去连接文库。如果说我们加入的文库数量太多，将芯片上的小抓手全部占满并且溢出的情况，则会出现信号叠加曝光过度的现象，也可以简单的理解为信号太密了，彼此间互相影响，无法采集信号，造成测序失败。这当然是我们不希望的。 因此，我们上机前在保证文库质量的前提下还需要做好文库的均一化，控制上机文库片段的数量。简而言之，先控制质量，再控制数量，两者缺一不可。 不同测序仪对上机的文库数量要求不一样。 如Miseq，最终上机数量要求6pM到20pM。 如果我们超过这个数量，加载的数量太大，测序仪对于文库的初始浓度负载量太大，就会出现芯片爆掉获取不了测序数据的情况。为保证我们的上机文库在这个范围内，我们需要先把文库的浓度稀释到4nM。 这里就涉及到文库浓度 到 文库数量的换算了。这个换算真的挺复杂的，笔者一度特别的迷糊，现在跟大家解释一下，希望能让大家不那么迷糊。 具体怎么换算呢？ 原则上，摩尔浓度=质量浓度/分子量 这里，一个碱基的平均分子量按1mol 660g左右计算，换言之每摩尔（6.02*10的23次方）的碱基对约为660克。基于Qubit定量结果按照下方公式进行换算，注意这里qubit得到的单位是ng/ul，换算成的结果单位是nmol哦 换算文库摩尔浓度的公式：
注：660是DNA中每个bp的平均分子量 举例： 2.44ng/ul（文库浓度）/(660g/mol*400bp（预估文库长度）)*1000000=9.24nM(文库摩尔) 根据计算结果，下面我们就可以开始用10mM的Tris-HCL（PH8.5）来稀释啦。 具体的稀释实操过程中，我们换算成目标摩尔浓度有2种计算公式，可供选择：
A.第一种方式是固定文库体积，计算取稀释文库溶液的体积，这种方式只适合单管稀释，不适合混管一起稀释。 文库摩尔数*取文库体积/目标文库浓度-取文库体积=取水体积 例如：
文库体积：5ul 计算所得取水体积：9.24*5/4-5=6.6ul 单管总体：11.6ul，再从中取5ul，与其他文库混合。 B.第二种方式是不固定文库体积，固定总体积。这种方式既适合单管稀释（如：红色方框标记)，也适合多个样本混管一起稀释，取水体积求和，文库全部加到一支离心管中(如：绿色框标记）。 例如：
计算取文库体积：4*40/9.24=17.32 计算取水体积：40-17.32=22.68 表中4个样本可加到一个总管中，最终总体积160ul。 以上两种方法可根据需要，二选一进行即可。最终的目标是一致的，都是为了获得4nM的均一化的文库。我们日常工作中多采用B方式做均一化。 以上均一化工作完成后，安全起见，我们可以再做一次复核Qubit，从经验上看，最后稀释或混合好的4nm文库用Qubit定量浓度大约范围在1~2ng/ul左右就可以啦。如过高或过低，有可能计算或操作有误，建议复查。 在换算到4nM后，我们还需要在上机前将文库变性再做进一步的稀释到20pM，这里就可以按照上机操作说明进行，不做详述啦。 大家感兴趣去看我们前贴《Miseq二代测序仪上机操作指南（图文版）》 好啦~关于文库均一化的2种计算方式总结完了，大家具体用哪种方式就看各位小仙友们了，希望能给使用到的友友们带来方便~ 长按关注 公众号名称：微微悦明 科学的乐趣是获得新知识的喜悦~ 高通量测序、大数据病原微生物检测和监测健康大数据行业资讯记录与分享 |
|
|
