研究背景 苦参碱是从我国传统中药苦参的干燥根中提取出的一种生物碱活性成分,具有广泛的药理学作用。近年来的研究表明,苦参碱能在体内外抑制多种肿瘤细胞的生长,并诱导肿瘤细胞凋亡。目前,国家大力提倡对祖国传统医学宝库中的传统中草药进行开发研究,采用分子生物学手段对其药理学作用给予新的解释,致力于研究开发出新的抗癌药物,来大力弘扬祖国传统医学,已成为当前中医药研究的发展趋势。在这样的大背景下,深入探讨苦参碱抑制肿瘤尤其是抑制实体瘤方面的作用,揭示其体内外抗癌作用的分子机制,无疑是一项很有前景和研究价值的课题,是非常有意义的。 目的 明确苦参碱是否具有抗大肠癌的作用并探讨其机制。首先在体外观测苦参碱对大肠癌细胞生长增殖的影响,分析苦参碱是否具有诱导大肠癌细胞凋亡的作用;然后通过动物实验观察苦参碱对小鼠的毒性和对小鼠免疫功能的影响;并建立裸鼠整体可视化大肠癌模型,研究苦参碱对裸鼠SW480-EGFP细胞移植瘤生长的影响;最后探讨苦参碱能否对Caspase家族、Bcl-2家族、p53和NF-κB家族mRNA和蛋白表达水平产生影响,找出苦参碱诱导SW480细胞凋亡的相关信号转导通路或靶点,阐明苦参碱抗大肠癌的可能机制。 方法 1.苦参碱对大肠癌细胞增殖能力的影响 利用四唑盐(MTT)比色法观察苦参碱对多种不同肿瘤细胞的增殖抑制效果以及苦参碱对大肠癌SW480和SW620细胞生长曲线的影响;通过倒置显微镜直接观察、细胞爬片苏木素—伊红(HE)染色观察分析苦参碱作用后SW480和SW620细胞的形态变化;应用流式细胞术检测苦参碱对SW480和SW620细胞周期和凋亡的影响。 2.苦参碱诱导大肠癌SW480细胞凋亡的研究 通过Annexin V-FITC/PI双标记法检测苦参碱对SW480细胞早期凋亡的影响;利用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染、Hoechst33342荧光染色、原位末端转移酶标记法(TUNEL)染色和透射电镜法观察苦参碱诱导的SW480细胞凋亡形态变化。利用琼脂糖凝胶电泳观察凋亡DNA的产生。 3.苦参碱对昆明小鼠的毒性研究 以昆明小鼠为研究对象,通过小鼠腹腔注射不同浓度的苦参碱溶液,观察并记录小鼠对苦参碱的毒性反应症状,取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和脑组织进行常规病理制片,HE染色,光镜观察。检测苦参碱对小鼠的致死中量(LD_(50))。 4.苦参碱的体内抑瘤作用 将稳定表达绿色荧光蛋白的大肠癌SW480-EGFP细胞种植于裸鼠皮下,建立裸鼠整体可视化大肠癌移植瘤模型。20只裸鼠随机分为四组:苦参碱低剂量(M_(low))组、苦参碱高剂量(M_(high))组、5-Fu阳性对照组和N.S.阴性对照组,均采用腹腔注射给药。苦参碱组为30和80 mg/kg·d~(-1),5-Fu组剂量为30 mg/kg,每5天1次。阴性对照组予生理盐水。给药4周后,处死裸鼠,量取肿瘤体积,观察肿瘤生长曲线的变化;剥瘤后称重计算苦参碱对裸鼠的大肠癌移植瘤的抑制率;肿瘤组织行常规病理组织学观察,超微结构行透射电镜观察。 5.苦参碱对昆明小鼠免疫器官的影响 将40只昆明小鼠分为苦参碱组、5-Fu组、苦参碱+5-Fu组和生理盐水(N.S.)阴性对照组。给药组小鼠分别按40、30、20+30 mg/kg腹腔注射给药。2周后处死,将胸腺、脾脏和肝脏称重,计算不同组别小鼠的胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数。胸腺、脾脏和肝脏组织行病理组织学观察。 6.苦参碱对大肠癌SW480细胞凋亡相关基因mRNA水平的影响 苦参碱作用不同时间后,提取SW480细胞的总RNA。利用primer5.0软件设计凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、p53和NF-κB家族IKKβ,NF-κB1,IκBα,以及看家基因β-acatin的上下游引物。应用RT-PCR检测SW480细胞中这些基因的表达水平,采用Quantity one 4.62软件进行区带的灰度分析,分别以目的基因和β-actin扩增带的密度比值表示0.50 mg/ml苦参碱处理不同时间SW480细胞中的表达水平。 7.苦参碱对大肠癌SW480细胞Caspase家族和Bcl-2蛋白表达水平的影响 免疫印迹法检测苦参碱对SW480细胞中Cleaved Caspase-3,Caspase-3,PARP,Cleaved PARP,Caspase-9,Cleaved Caspase-9,Caspase-7,cleaved Caspase-7和Bcl-2蛋白表达水平的影响。 8.苦参碱对大肠癌SW480细胞核转录因子NF-κB家族的影响 免疫印迹法检测苦参碱对SW480细胞中IKKα,IKKβ,Phospho-IKKα/β,NF-κB p65,Phospho-NFκB p65,IκBα,Phospho-IκB-α各蛋白表达水平的影响。 结果 1.苦参碱对大肠癌细胞增殖和细胞周期的影响 1.1苦参碱对不同肿瘤细胞增殖的影响 MTT结果显示,苦参碱0.25 mg/ml作用于细胞24 h后,与阴性对照组相比,SW480、SW480-EGFP和Lovo细胞的增殖明显受到抑制(P＜0.05),而SW620、MGC803、SGC7901、Eca109和MCF-7五种细胞株与对照组相比则无显著性差异(P＞0.05)。随着苦参碱剂量的增加,肿瘤细胞的生长抑制率也随之升高,表明苦参碱以剂量依赖方式抑制肿瘤细胞的增殖。苦参碱对不同细胞的增殖抑制能力为SW480-EGFP＞SW480＞SGC7901＞MGC803＞SW620＞Eca109＞Lovo＞MCF-7,提示苦参碱对不同肿瘤细胞的生长抑制有一定的针对性。对胃肠道肿瘤细胞株的生长抑制作用较强,而对乳腺癌MCF-7细胞则较弱。 1.2苦参碱对大肠癌SW480和SW620细胞增殖的影响 苦参碱对SW480细胞的生长抑制有效浓度从0.25 mg/ml开始,而SW620细胞则从0.50 mg/ml开始。随着药物浓度的增加和作用时间的延长,苦参碱对SW480和SW620细胞的生长抑制作用也就更明显。在低浓度(0.25、0.50、1.00mg/ml)时呈时间与剂量依赖性,但高浓度(1.50、2.00 mg/ml)时,苦参碱在48 h可将SW480细胞全部杀死。相同浓度下,SW620细胞的生长抑制率在24 h和48 h差异不显著(P＞0.05),而72 h与24 h、48 h相比有统计学意义(P＜0.05)。说明苦参碱对SW620细胞的生长抑制作用在48 h后显著增强。另外,与SW620细胞相比,相同浓度的苦参碱对SW480细胞的生长抑制作用更强。 形态学观察结果显示,苦参碱处理后的SW480和SW620细胞胞体缩小,胞浆中出现大量空泡以及形成所谓的“印戒样细胞”。 1.3苦参碱对SW480和SW620细胞周期和凋亡的影响 不同剂量苦参碱处理SW480和SW620细胞24 h以后,流式细胞仪检测细胞周期结果显示,随着苦参碱剂量的增加,G_1期细胞比例增加,S期减少,而G_2/M期变化不明显。细胞增殖指数降低。0.25和0.50 mg/ml苦参碱均可诱导SW480细胞发生凋亡,有凋亡峰出现;而SW620细胞则没有明显凋亡峰出现。 苦参碱对细胞周期的影响作用与浓度成正比,具有明显的剂量依赖性,显示苦参碱可有效抑制SW480细胞周期的正常转换,使细胞在G_1期堆积,导致细胞阻滞于G_0/G_1期,从而阻止细胞的有丝分裂,使细胞增殖受到抑制。 2.苦参碱诱导SW480细胞凋亡的研究 2.1 Annexin V标记法检测苦参碱诱导SW480细胞凋亡 Annexin V法检测到0.50 mg/ml苦参碱作用SW480细胞24、48 h后,细胞凋亡率分别是(3.77±0.47)%和(22.73±1.78)%,与对照组自发凋亡率(1.26±0.31)%相比均有显著性差异(P＜0.05)。 2.2苦参碱诱导SW480细胞凋亡的形态学变化 AO/EB荧光双染、Hoechst33342荧光染色和Tunel染色结果显示,苦参碱0.50mg/ml作用SW480细胞24和48 h后,荧光显微镜观察到SW480细胞呈典型的凋亡形态变化。早期凋亡细胞细胞变圆、不贴壁、质膜肿胀、膜发泡,核固缩;晚期凋亡细胞核染色质固缩,断裂或凋亡小体形成等等。透射电镜下可见凋亡细胞核染色质凝聚、边集,部分细胞核膜消失,细胞浆出现空泡,细胞表面微绒毛消失,胞膜完整。 2.3琼脂糖凝胶电泳检测凋亡的DNA 凋亡的细胞在电泳时会出现特征性的DNA梯状条带。我们用不同剂量苦参碱处理细胞后,提取总DNA进行电泳。结果表明,苦参碱干预48 h后的细胞出现明显的DNA Ladder梯状条带,而对照组和苦参碱作用12、24 h后的细胞DNA不显现,72 h时可见隐约的梯状条带,但主要为弥散的坏死条带。由此可以明确,苦参碱在体外能诱导细胞凋亡。 3.苦参碱对昆明小鼠的毒性研究 急性毒性实验结果表明,昆明小鼠对苦参碱的耐受剂量大于80 mg/kg。将苦参碱对小鼠的致死中量(LD_(50))的检测结果进行Probit统计分析,回归方程为PROBIT=6.54359-14.37149X,χ~2=0.247,P=0.970,拟合良好。苦参碱的半数致死剂量(即Prob=0.50)时为157.13 mg/kg,其95%可信区间为(88.08-280.31)mg/kg。 4.苦参碱的体内抑瘤作用 各实验组裸鼠皮下接种SW480-EGFP细胞7 d后,借助整体荧光成像系统观察,可见皮下瘤块发出明亮绿色荧光,成瘤率100%。 与N.S.对照组相比,从给药第14 d(即接种瘤细胞21 d)开始,M_(high)组和5-Fu组抑制肿瘤生长的作用有显著性意义(P=0.046,P=0.020),但M_(low)组与对照组相比则无显著性差异(P=0.169)。至给药后28d裸鼠处死,M_(high)组裸鼠的移植瘤体积为(136.38±104.97)mm~3,与N.S.对照组的(488.64±143.73)mm~3相比有显著性差异(P=0.005);而与5-Fu组的(128.44±28.85)mm~3相比无显著性差异(p=1.000)。M_(low)处理组裸鼠的移植瘤体积为(333.29±73.00)mm~3,与N.S对照组相比无统计学意义(P=0.257)。提示低剂量苦参碱对裸鼠移植瘤的生长抑制能力较弱,而高剂量则能显著抑制肿瘤生长。 移植瘤质量结果表明,M_(low)组、M_(high)组和5-Fu组的抑瘤率分别为11.90%、59.52%和65.38%。肿瘤组织光镜及透射电镜超微结构观察结果显示,用药组除见到大量坏死细胞外,尚有凋亡细胞存在。 5.苦参碱对昆明小鼠免疫器官指数的影响 与阴性对照组相比,苦参碱组小鼠的胸腺、脾脏和肝脏指数均无显著变化(P＞0.05);5-Fu组小鼠胸腺和脾脏指数均显著降低(P＜0.01)。苦参碱+5-Fu组小鼠的胸腺指数与对照组相比显著降低(P＜0.01)。 苦参碱+5-Fu组小鼠脾脏指数与5-Fu组相比均有显著性差异(P＜0.01),与对照组、苦参碱组比较无显著性差异(P＞0.05);提示苦参碱可以拮抗5-Fu对脾脏的免疫抑制,使脾脏指数增加。 病理组织学光镜观察结果显示,苦参碱组小鼠胸腺和脾脏没有明显的萎缩和破坏,肝脏组织无明显病理变化。5-Fu组小鼠胸腺和脾脏皮质萎缩,淋巴细胞数目减少,髓质内组织细胞和纤维细胞增生明显;苦参碱+5-Fu组小鼠胸腺和脾脏的病理改变与5-Fu组类似,但病变程度稍轻。 6.苦参碱对大肠癌SW480细胞凋亡相关基因mRNA表达水平的影响 结果表明caspase-3、NF-κB1基因mRNA随苦参碱作用时间的延长,表达量逐渐增加,Bcl-2表达逐渐降低,IKKβ表达略有增加,而p53和IκB-α表达量变化不大。 7.苦参碱对细胞中Caspase家族和Bcl-2蛋白表达影响 苦参碱0.50 mg/ml作用SW480细胞24 h后,caspase-3被激活,发生剪切,并随着作用时间的延长而增多,说明caspase-3的激活具有时间依赖性。caspase-7只在48 h时被激活,而caspase-9只在8 h时被激活,表明这两种蛋白的激活具有时间特异性。Bcl-2在苦参碱作用8 h后表达减少,随着作用时间的延长,其表达量逐渐降低。 8.苦参碱对大肠癌SW480细胞核转录因子NF-κB家族的影响 结果显示,苦参碱0.50 mg/ml作用24 h后,未磷酸化的IKKα和IKKβ表达降低,磷酸化IKKβ表达增多,磷酸化的IKKα未检测出。未磷酸化和磷酸化的IκBα表达均增加。磷酸化p65的表达随着作用时间的延长而增加。表明苦参碱主要通过经典途径激活NF-κB通路。 结论 1.苦参碱在体外能以剂量和时间依赖的方式抑制大肠癌SW480和SW620细胞增殖; 2.苦参碱可显著抑制裸鼠体内大肠癌细胞的生长; 3.苦参碱使caspase-3和NF-κB1基因mRNA表达增加,Bcl-2表达降低,通过激活NF-κB通路,诱导SW480细胞凋亡。……
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