如何实现更加灵敏、快速的miRNA检测

上期我们就“如何查找miRNA”进行了详细的介绍，让我们能够更加准确获取miRNA名称、Accession Number等重要 “身份标识”，从而才能更加精准的开启miRNA的检测、分析、功能等研究等。在众多相关实验中，数miRNA研究的表达分析最为基础、常见，而根据研究目的不同，一般会有两种实验方案。一种是检测miRNA在不同组织、部位的时空表达，另外一种是利用qPCR、dPCR或NGS等定量方法直接对样本中的miRNA表达量进行检测。今天，我们就先针对miRNA的PCR定量检测方案展开阐述。

miRNA定量检测之反转录

在miRNA的PCR定量检测实验中，由于miRNA的长度在22nt左右，而引物的的一般长度是15-30nt，无法做到根据其序列直接设计引物用于PCR扩增，因此实验的第一步通常是在miRNA的反转录中利用一些特定的方法使得得到的cDNA得以延长，从而更加有助于下游检测。通常有两种反转录的方法，即“茎环法”和“加尾法”。

一

茎环法反转录

顾名思义，此方法核心在于实验中会引入一段茎环结构的片段，后面再加6-8个与miRNA成熟体互补的序列。

miRNA茎环法反转录及定量检测示意图^[1]

以dme-miR-12-3p为例设计引物，其成熟体序列为：CAGUACUUAUGUCAUACUACGC，可以形成茎环一段固定的序列为：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG TTGAG-3’。

在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是dme-miR-12-3p的最后6-8位碱基的互补序列，也就是从后面数八个碱基的反向互补序列，即UACUACGC的反向互补：ATGATGCG，最后得到的反向引物的序列为：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTT GAGATGATGCG-3’

由此可见，使用茎环法来进行miRNA的反转录，因使用的是特异性的茎环引物，通常一次反转录实验只能检测一个miRNA，且设计茎环引物较为复杂，因此难以实现高通量的miRNA检测，并且耗费的试剂、样品、时间也都较长，特别是对于微量样本等具有一定难度的检测难以满足要求。那么，是否有更好的解决方案？加尾法反转录便应运而生。

二

加尾法反转录

在基于此方法的反转录实验中，miRNA的3’末端会首先被加上一段Poly(A)尾序列，不仅增加了产物的长度，也为下一步基于Oligo(dT)引物的反转录过程提供了可能，从而可针对全部miRNA实现高效、通用的“一次性”miRNA反转录，为下游的多靶标、高通量检测奠定了基础。

加尾法反转录示意图（miRCURY LNA RT Kit）

QIAGEN为您提供基于加尾法的通用型miRNA反转录试剂盒- miRCURY LNA RT Kit，实现miRNA高通量逆转录。

• 快速、简单的操作

• 节省时间和成本

• 核心技术保障成熟体miRNA的特异性检测

另外，在前期的提取、反转录过程可搭配我们可提供的“RNA Spike-ins”，实现对从miRNA纯化、cDNA合成和 PCR扩增过程的每个环节进行质控，并可针对特殊样本用于数据的均一化。

miRNA定量检测之qPCR

miRNA经过反转录成cDNA后，下一步就要开展qPCR实验了。目前，常采用的qPCR的方法有染料法和探针法，这两种方法都有自己独特的优势，但无论采取哪种方法在miRNA定量检测中普遍面临的挑战有：

• miRNA序列短，很难正常设计qPCR上下游引物

• miRNA序列高度同源，许多miRNA间只差一个碱基

• miRNA GC含量差别大（20—95%），扩增效率难以兼顾

• miRNA表达量差别大，低丰度miRNA 难以检测

QIAGEN基于强大的LNA技术，能够轻松攻破以上难题！据此而设计推出的miRCURY LNA miRNA SYBR^® Green PCR和miRCURY LNA miRNA Probe PCR系统，能够高灵敏、特异地实现miRNA的PCR定量检测，灵活满足不同客户对于检测方法学的需求。

LNA是什么？可以解决什么问题？

锁核酸（Locked Nucleic Acid，LNA）是一种含有双糖环的核苷酸衍生物，通过2'氧原子和4'碳原子之间的亚甲基桥键，将糖环锁定成为一个双环的分子模式。

LNA依然遵循碱基互补配对原则，且具有更强的亲和力，引物或探针等寡核苷酸链中平均每增加一个LNA，Tm值都会有2-8℃的提高。从而实现了以更短的序列达到较高的Tm值，从而不仅保障了检测的特异性，灵敏度也能得到极大提升；同时，引物设计时，也可以通过LNA对同一检测体系中针对不同靶标引物的Tm进行调节，保障不同GC含量的miRNA能够以较为均一的效率被扩增，从而提高qPCR检测结果的准确性。

一

miRCURY LNA miRNA SYBR® Green PCR系统

染料法qPCR示意图

在染料法qPCR中，由于LNA的引入，使得miRNA引物序列虽然需要很短，但依然能够“极为独特地”设计出上、下游均具有特异性的引物，极大提高了染料法PCR检测的特异性。

二

miRCURY LNA miRNA Probe PCR系统

探针法qPCR示意图

在探针法qPCR中，LNA的引入同样使得探针和引物具有更高的特异性，“双保险”让miRNA的检测更加精准。

目前，无论是染料法还是探针法系统，都是基于QIAGEN先进的PCR mix系统开发优化，可以实现：

• 更为快速、简便的扩增实验流程

• 低质单拷贝的检测灵敏度，支持最低8个数量级的起始模板量

• 支持长期4℃保存及室温体系配制、保存

• 标志性的加样变色指示，告别加样错误，孔板操作更加安心

miRCURY LNA miRNA系统可提供多个物种中大量miRNA的预制assay，并支持定制，用于qPCR或dPCR平台的检测。除用于单个检测的assay产品外，还可将多个靶标定制在一款96、384孔板上，实现更加灵活、更高通量的检测。

miRNA研究之NGS检测

当然，基于PCR方法的miRNA定量检测更多用于已知miRNA的检测，对于未知miRNA的检测或者更多靶标检测的需求，还可考虑通过NGS的方法进行检测。然而，在一般的miRNA建库流程中是会把所有的RNA构建到文库中，再割胶纯化，整个流程繁琐、耗时长、效率低且有可能会造成miRNA的丢失。

QIAGEN独特的miRNA的二代测序方案，最低起始量仅需1ng总RNA，且无需再切胶回收。在该文库过程中，基于“核心技术”，在3'接头的连接中只能特异性识别并连接50nt以下的小RNA，因此构建的文库直接排除了大部分大片段进入到最终的文库中，反转录过程中UMI的引入也让最终的定量结果更加精准。此外，还有QIAGEN“黑科技”——Y RNA的封闭技术的加持。这个技术的引入可以封闭非目标RNA，使得这些非目标RNA不能构建到文库中，从而让miRNA的数据占比有了明显提高，有效数据更多，检测也更精准。

以上便是如何基于PCR或NGS进行miRNA定量检测的实验方案介绍，通常在获得目标miRNA的表达量或基于表达量进行miRNA筛选后，便会继续进行miRNA的功能研究，那么功能研究又将如何开展？实验中又有哪些注意事项？敬请期待下期- “如何获得更精准的miRNA功能研究实验结果？”