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实验是简单的，道路是曲折的，科研的道路上时间是不能浪费的，今天就要聊一聊环凯高性价比的CCK8，让同学们的细胞实验做的又快又好，导师再也不用为我们担心啦！  1.基本原理CCK-8细胞活力检测试剂盒含有WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)（CAS:193149-74-5），在电子载体存在的情况下WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成水溶性的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。  图 1. WST-8 反应原理图  图2. CCK-8 检测细胞活性原理图 2、产品用途CCK-8法应用非常广泛，主要用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验、活细胞计数、细胞活力检测以及生物因子的活性检测等。 3、各种细胞增殖/毒性检测方法的比较 图3. 细胞增殖/毒性检测方法的比较 4、CCK-8 的实验方法与步骤应用场景一：细胞活性检测1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入 100ul， 使待测细胞密度为1,000～10,000细胞/孔。 2. 5% CO2，37℃ 培养细胞 24 小时（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少进行调整）。 3. 每孔加入10ul CCK-8 溶液。如果起始的培养体积200ul，则需加入 20ul CCK-8 溶液，其它情况以此类推。 4. 在细胞培养箱内继续孵育 0.5～4 小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等情况而定（一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量 (～105细胞/孔)。悬浮细胞较贴壁细胞难显色。对于悬浮细胞，在加入CCK- 8孵育1～4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定CCK- 8最佳孵育时间。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞，CCK- 8的孵育时间一般为1～4小时，多数细胞培养30分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应，培养3.5～4小时左右检测效果最佳。 5. 酶标仪于450nm测定每孔吸光度。 应用场景二：细胞增殖-毒性检测1. 收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入 100ul， 使待测细胞密度为1,000～10,000细胞/孔。 2. 5% CO2，37℃ 培养细胞 24 小时（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少进行调整）。 3. 加入10ul不同浓度的待测物质，将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 （例如 6、12、24 或 48 小时或72小时等，根据待测物质的活性调整孵育时间）。 4. 每孔加入10ul CCK-8 溶液。如果起始的培养体积200ul，则需加入 20ul CCK-8 溶液，其它情况以此类推。 5. 在细胞培养箱内继续孵育 0.5～4 小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等情况而定（一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量 (～105个细胞/孔)。悬浮细胞较贴壁细胞难显色。对于悬浮细胞，在加入CCK-8孵育1～4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定CCK- 8最佳孵育时间。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞，CCK- 8的孵育时间一般为1～4小时，多数细胞在培养30分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应，培养3.5～4小时左右检测效果最佳。 6. 酶标仪于450nm测定每孔吸光度。  图 4. CCK-8检测实验操作示意图 测定吸光度值（OD值）时的特别提醒： CK8试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂则会干扰检测，需设法去除。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。 如何判定待测溶液是否有还原性？不含细胞的待测溶液孔中加入CCK-8溶液10μl，孵育1-4小时，测定在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度值很小，说明待检测体系中存在较少的还原剂，正式检测时即可直接加入CCK-8；如果该吸光度相对较大，说明待检测体系中存在较多的还原剂，正式检测时则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基和10ul CCK-8进行检测。 计算公式： 细胞存活率 = [（实验孔 — 空白孔）/ （对照孔 — 空白孔）] × 100% 抑制率 = [（对照孔 — 实验孔） / （对照孔 — 空白孔）] × 100% 实验孔 （含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质） 对照孔 （含有细胞的培养基、CCK-8，不含有待测物质） 空白孔 （不含细胞和待测物质的培养基，含有CCK-8） 注意事项1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种合适的细胞数量和加入CCK-8 试剂后合适的培养时间。 2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。 3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。 4. 建议采用多通道移液器，减少平行孔间的误差，加 CCK-8 时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰 OD 值。 5. 若细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。 6. CCK-8对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法，也可在CCK-8 法检测完后继续进行。 7. 可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。 8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较 （只加 CCK-8 试剂），如果 OD 值明显偏高，则说明有反应，正式检测时则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基和10ul CCK-8进行检测。 9. 加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。 10. CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。 来源：“恩晶生物”公众号 |
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