NK细胞杀伤功能

井里的怪兽 2022-05-07 发布于浙江省

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NK细胞通过直接识别靶细胞、释放穿孔素、NK细胞毒因子、TNF-α/β等杀伤因子杀伤靶细胞。

肿瘤特异性受体和细胞毒性融合蛋白的表达增强le NK细胞抗肿瘤活性。(A)自然杀伤(NK)细胞对肿瘤细胞的自然细胞毒性受刺激受体(NCRs)和NKG2D以及抑制性受体（如抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs）的控制。（B）肿瘤相关细胞表面抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)的表达有效地将NK细胞重定向到恶性细胞，并促进其细胞溶解活性而不依赖于内源性刺激受体的激活。（C）或者，NK细胞可以被修饰以表达靶向的细胞毒性嵌合体，如促凋亡丝氨酸蛋白酶颗粒酶B(GrB)融合到肿瘤细胞特异性配体或抗体片段。这些分子与内源性颗粒酶和穿孔素一起储存在细胞毒性颗粒中。当内源性NK细胞受体激活时，肿瘤靶向GrB与穿孔素一起释放，因此可以与自然细胞毒性机制合作杀死靶细胞。尽管如此，通过内源性NK细胞刺激受体的信号不足可以重定向GrB变异体的释放。（D）这一问题可以通过肿瘤靶向GrB衍生物与CAR的共同表达来克服，该CAR确保NK细胞的激活，即使是通过其他耐药的癌细胞。在这种情况下，CAR和靶向GrB可能指向相同或不同的肿瘤相关细胞表面抗原。

K562细胞是人白血病细胞系，其HLAⅠ型表达降低，而活化的NK细胞受体配体表达增高，使其特别易受NK细胞介导的细胞毒性作用的影响。将NK细胞与靶细胞（通常是K562细胞）共培养，然后通过检测靶细胞释放的酶或者用CAM、CFSE标记靶细胞，通过检测荧光，从而得出NK细胞的杀伤活性。

NK杀伤结果.jpg

几种检测方法比如下：

检测方法	CCK8	WST-1	XTT	MTT
甲臜的水溶性	好	好	好	差
检测灵敏度	很高	高	高	高
检测时间	最短	较短	较短	较长
检测波长	430-490 nm	420-480 nm	420-480 nm	560-600 nm
细胞毒性	很低	很低	很低	高
细胞类型	任何细胞	任何细胞	任何细胞	不适合悬浮细胞
细胞形态	不变	不变	不变	完全消失

一. 主要材料和试剂

货号	名称
V13154	Vybrant™ MTT Cell Viability Assay
88954	Pierce™ LDH Cytotoxicity Assay Kit
CK04	Cell Counting Kit-8
65-0853-39	eBioscience™ Calcein AM Viability Dye (UltraPure Grade)
65-0853-78	eBioscience™ Calcein AM Viability Dye (UltraPure Grade)
65-0855-39	eBioscience™ Calcein AM Viability Dye
65-0850-84	CFSE

二. NK细胞杀伤

2.1 LDH释放检测杀伤

2.1.1乳酸脱氢酶 (LDH) 检测杀伤原理

乳酸脱氢酶 (LDH) 是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，LDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH释放至培养基中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺) 变成还原型辅酶Ⅰ(NADH)。后者再通过黄递酶还原硝基氯化四氮唑蓝(INT)，形成有色的甲臢类化合物，在490nm处有一高吸收峰。利用读取的A值，经过计算即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性。甲臢的形成水平与释放到培养基中的LDH的数量成正比。

LDH杀伤示意图.jpg

图1 LDH释放检测细胞杀伤活性原理

2.1.2 实验步骤

1. 调整效应细胞（NK细胞）密度至4.0×10⁶ /mL、靶细胞（K562细胞）密度至1.0×10⁵ /mL 。

2. 取96孔圆底培养板，每个样本做3次重复，按效靶比40：1、20：1、10：1加入效应细胞与靶细胞，每孔体积为100 µL。设置与实验孔相同数量的效应细胞自然释放对照孔，加培养基使每孔终体积为100 µL。设置与实验孔相同数量的靶细胞最大释放对照孔，加培养基使每孔终体积为90 µL（步骤4加10 µL裂解液）。设置与实验孔相同数量的靶细胞自然释放对照孔，加培养基使每孔终体积为100 µL。设本底（每孔100 µL NK细胞培养基）和体积纠正孔（每孔90 µL NK细胞培养基+10 µL 裂解液（步骤4加入））。

3. 在效应细胞和靶细胞自发释放孔中加入10 µL无菌、超纯水。

96孔示意图(LDH)圆圈.jpg

图 2 96孔板NK杀伤实验示意图

4. 将培养板放于37℃、5%CO₂培养箱中孵育4小时。

5. 在最大孔和体积纠正孔中加入10 µL裂解缓冲液，孵育45分钟。

6. 250 x g 离心3分钟，每孔吸出50 µL上清液于相应平底培养板，避光加入50 µL反应底物，室温（15-25℃）避光30分钟，待各孔液体颜色转深时每孔加入50 µL终止液，轻拍培养板混匀。。

7. 将96孔板置于酶标仪检测490 nm和680 nm波长处的吸光值。为了确定LDH活性，应从490 nm处的吸光值中减去680 nm(来自仪器的背景信号)的吸光值（D）。

8. 为了计算准确，应该从实验平均值，效应细胞自发释放LDH对照值和靶细胞自发释放LDH对照值中减去本底对照平均值。体积纠正孔对照值应从靶细胞最大体积LDH释放对照中去除。

9. 用下列公式，计算每组E:T杀伤率%。

NK杀伤率（%）=（实验D值-效应细胞自然释放孔D值-靶细胞自然释放孔D值/（靶细胞裂解释放孔D值-靶细胞自然释放孔D值）×100%.

2.2 CCK8检测杀伤

2.2.1 CCK8检测杀伤原理

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan dye）。生成的甲臜的数量与活细胞的数量成正比。该方法通常作为MTT法的替代方法。

CCK8原理.jpg

图4 CCK8检测杀伤原理

2.2.2 实验步骤

1. K562细胞传代培养，取生长旺盛的细胞备用。用NK细胞培养液将细胞密度调为1×10⁵ /mL。

2. 培养后的NK细胞调整细胞密度为1×10⁶ /mL、 5×10⁵ /mL、1×10⁵/mL。

3. 将效靶比=10:1、5:1、1:1的NK细胞（效）、 K562细胞（靶）加入96孔圆底板,，实验组分别加入各效靶比的效、靶细胞各50 µL/孔，均设3个复孔。同时设靶细胞孔（50 µL细胞悬液+50 µL培养基）及效应细胞（50 µL细胞悬液+50 µL培养基）孔作为对照孔。另加空白对照孔（NK细胞培养基100 µL / 孔），1孔。

96孔示意图(CCK8)圆圈.jpg

图5 CCK8检测96孔板杀伤示意图

4. 震荡混匀，37℃、5% CO₂培养箱孵育12小时。

5. 每孔加入10 µL CCK8 (5 mg/ml)，充分震荡混匀，37℃、5% CO₂培养箱继续孵育4小时。

6. 用酶标仪检测450 nm波长OD值。按下述公式计算杀伤率:

NK杀伤率( %)=［1－(效靶细胞孔OD值－效应细胞孔OD值) / 靶细胞孔D值］×100%

2.3 MTT检测杀伤

2.3.1 MTT检测杀伤原理

四甲基偶氮唑盐 (MTT) 是一种黄色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，将淡黄色的MTT还原成蓝紫色、不溶于水的甲臜颗粒。该颗粒溶解后，其液体的吸光度OD值与活细胞数及细胞代谢活性呈正相关。因此吸光度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会产生甲臜。

2.3.2 实验步骤

1. K562细胞传代培养，取生长旺盛的细胞备用,用NK细胞培养液将细胞密度调为1×10⁵ /mL。

2. 培养后的NK细胞调整细胞密度为5×10⁶ /mL、2.5×10⁶ /mL。

3. 将效靶比=50:1、25:1的NK细胞（效）、 K562细胞（靶）加入96孔圆底板, 实验组分别加入各效靶比的效、靶细胞各50 µL/孔，均设3个复孔。同时设靶细胞孔及效应细胞孔作为对照孔。另加仪器调零孔NK细胞培养基100 µL / 孔，1孔。

96孔示意图(MTT)圆圈.jpg

图6 MTT检测96孔板杀伤示意图

4. 置37℃、5% CO2培养箱培养4小时。

5. 每孔加入10 µL MTT (12 mM母液)，继续孵育4小时。

注意：用1 mL PBS溶解5 mg MTT(组份A)配置12 mM的MTT母液。详见说明书。

6. 3000 rpm，离心10分钟，弃上清，每孔加DMSO 50 µL，充分混匀，10分钟内酶标仪检测570 nm波长A值。按下述公式计算杀伤率:

NK杀伤率( %)=［1－(条件OD值－效应细胞孔OD值) / 靶细胞孔OD值］×100%

2.4 CAM标记靶细胞检测杀伤

2.4.1 CAM标记靶细胞检测杀伤原理

Calcein-AM（CAM）是一种可以透过细胞膜的活细胞标记染料^[10-11]。进入细胞后，细胞内酯酶会切断乙酰羟甲基酯（AM）的酯基，产生无法透过细胞膜的 Calcein 荧光染料。凋亡细胞和死细胞的细胞膜已被破坏，无法保留 Calcein。Calcein 的最佳激发波长为 495 nm，发射波长为 515 nm。

2.4.2 实验步骤

共培养.jpg

图 7 CAM标记靶细胞杀伤实验流程图

1. 杀伤检测前一天，复苏一支已经冻存的NK细胞并接种于NK细胞培养基中（培养的NK细胞忽略此步骤）。

2. 对于每个细胞杀伤检测试验，使用一种靶细胞系，需要6x10⁵ NK细胞和3x10⁵靶细胞。

注意：用NK细胞培养基将NK细胞和CAM染色的靶细胞（急性髓系白血病AML10和AML 13细胞）的密度分别调至1x106细胞/mL和1x105细胞/mL用于细胞毒性测定实验。另外，推荐的NK细胞数是专门针对方案中显示的E:T比例，如果使用较高的效：靶（E：T）比值相应增加NK细胞数（例如，对于40:1 E:T比使用4x106细胞/mL）。

3. 通过用NK细胞培养基稀释CAM（以1 mg/mL母液储存于DMSO中）制备CAM染色液。建议使用1:500，1:400，1:300， 1:200和1:100的稀释度对CAM进行稀释滴定，以达到最优浓度，使染色效果最佳。

4. 用1 mL CAM染色液重悬1 x 10⁶ 靶细胞。37℃，孵育1小时，期间时常对细胞进行晃动。

5. 重悬NK细胞至1x10⁶ 细胞/mL，然后在圆底96孔板前三孔（A1、B1、C1）添加200 µL NK细胞悬液。

6. 除达到最大体积的培养孔，在其它所有剩余的培养孔中添加100 μL完全培养基。

7. 在最大体积培养孔中加入100 μL 2% Triton X-100。

8. 通过每次转移100 μL细胞，进行NK细胞梯度稀释，从而达到5个梯度的E: T比例。混匀。从最后一个培养孔中去掉100 μL（E:T为0.3125: 1）。

96孔示意图(CAM)圆圈.jpg

图8 CAM标记染色靶细胞检测杀伤96孔示意图

9. CAM标记靶细胞1小时后，用NK细胞培养基洗涤细胞两次，400 x g 离心5分钟。

10.再次计数靶细胞，并重悬至1x10⁵ 细胞/mL。

11.每孔中加入100 μL（1x10⁴细胞）靶细胞。100 x g离心1分钟以便效应细胞和靶细胞接触。

12. 37℃，5% CO2条件下孵育4小时。

13. 用100 μL移液管轻轻混匀培养物，使释放的CAM分布均匀，100 x g慢速离心培养板5分钟使细胞成团并将100 μL上清液小心转移至新的培养板，避免产生气泡。如果有气泡可以用针将气泡刺破。

14. 采用荧光读板器读板（激发波485 nm，发射波530 nm）或流式进行分析。最大体积培养孔中得到最大释放量，其余培养孔获得测试释放量。

根据公式[（测试释放量-效应细胞自发释放量）/（最大释放量-效应细胞自发释放量）x 100计算裂解百分比。

2.4.3 结果分析

NK杀伤CAM结果分析.png

图8 NK细胞对AML细胞的杀伤（用特异性裂解百分率表示NK细胞对AML的杀伤）

2.5 CFSE标记靶细胞检测杀伤

2.5.1 CFSE标记靶细胞检测杀伤

CFSE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester）即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个琥珀酰亚胺酯功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内后，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的琥珀酰亚胺酯基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白化合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度，从而进行细胞示踪和细胞增殖以及细胞毒性T 淋巴细胞 (CTL) 测定研究。

2.5.2 实验步骤

1. 用NK细胞培养基将预先培养好、生长旺盛的K562细胞重悬至细胞密度为1x10⁶细胞/mL。

2. 将500 µL CFSE溶液加入到500 µL （5x10⁵细胞）K562细胞悬液当中，上下吹打2-3次，混匀，使其终浓度达到0.5 µM。

注意：在500 µL NK细胞培养基中加入2 µL的CFSE 母液（5 mM）。涡旋，以便旋下瓶盖上的液体。然后将刚制备的50 µL CFSE 溶液加入950 µL NK细胞培养基进行1：20稀释，获得1 μM 的 2倍工作液。涡旋混匀，避光保存。

3. 5% CO₂、37℃恒温箱中避光孵育10分钟。

4. 室温下，用10 mL的完NK细胞培养基避光终止反应10分钟。

5. 140× g，离心标记的K562细胞7分钟，弃上清并用1 mL NK细胞完全培养基重悬细胞。

6. 计数靶细胞并重悬使其终浓度为1x10⁵细胞/mL。

7. 使用前，细胞可在室温下保存10分钟或者可将其置于37℃、5%CO₂的恒温箱中直至使用。不要冷藏。

8. 使用96孔圆底培养板，按下列要求接种细胞（效应细胞：靶细胞，E：T）：（1）E: T=5: 1+IL-2（阳性对照）、（2）E: T=5: 1、（3）E:T=2.5: 1、（4）1.25: 1、（5）E:T=0.625: 1、（6）靶细胞（K562死亡阴性对照）、（7）效用细胞、（8）靶细胞+吐温（K562细胞死亡阳性对照）。各设三个重复。

96孔示意图(CFSE)圆圈.jpg

图9 CFSE标记染色靶细胞检测杀伤96孔示意图

9. 在（3）、（4）、（5）、（6）、（7）条件孔中各加入100 μL NK细胞完全培养基。

10. 在（1）、（2）、（3）条件孔中加入100 μL 效应细胞（NK细胞浓度5x105细胞/ mL）。通过依次稀释，在（4）-（7）条件孔中加入效应细胞。

i. 混合条件（3）孔，然后吸取100 μL加入条件（4）孔。

ii. 混合条件（4）孔，然后吸取100 μL加入条件（5）孔。

iii. 混合条件（5）孔，然后吸取100 μL加入条件（7）孔。条件（6）孔不加效应细胞。

11. 在条件（8）孔中加入100 μL制备的2倍体积0.2%吐温液（终浓度为：0.1%-吐温20），条件（8）孔中不加效应细胞。

12.在条件（1）孔中加入30 μL IL-2。在加入靶细胞悬液之前，应在效应细胞悬液中加入IL-2(终浓度为27 IU/mL)。

13. 在条件（1），（2），（3），（4），（5），（6），（8）孔中下加入100 μL 靶细胞(标记的靶细胞浓度为1x105细胞/mL)。

14. 混匀培养板，120 x g离心2分钟，以便使效应细胞和靶细胞充分接触。

15. 37℃，CO₂恒温箱中孵育4小时。孵育结束后，将培养板置于冰上进行活细胞染色30分钟。

16. 将3 μL 5 μM SYTOX™ Red死细胞染色液加入到600 μLPBS中。

17. 在每个培养孔中加入50 μL稀释后的死细胞染色液，使终体积为250 μL，染色液终浓度为0.005 μM。

18. 进行流式细胞分析。

2.5.3 结果分析

CFSE杀伤结果图.png

图20 靶细胞检测设门

（A）最初的门设置在FITC-A/SSC-A点图中，CFSE细胞群为K562细胞为（B）死亡的K562细胞（细胞染色阳性群）在后面的APC-A/SCC-A点图中设门

参考文献：

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2. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., et al. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells [J]. J Immunol, 118 (1), 355-361 (1977)

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